Nature.com پر جانے کا شکریہ۔براؤزر کا جو ورژن آپ استعمال کر رہے ہیں وہ محدود CSS سپورٹ رکھتا ہے۔بہترین نتائج کے لیے، ہم تجویز کرتے ہیں کہ آپ اپنے براؤزر کا نیا ورژن استعمال کریں (یا انٹرنیٹ ایکسپلورر میں مطابقت موڈ کو غیر فعال کریں)۔اس دوران، جاری تعاون کو یقینی بنانے کے لیے، ہم سائٹ کو اسٹائل یا جاوا اسکرپٹ کے بغیر دکھا رہے ہیں۔
قدرتی مصنوعات کی دریافت اور فائدہ مند استعمال سے انسانی زندگی کو بہتر بنانے میں مدد مل سکتی ہے۔پودوں کی نشوونما روکنے والے کیمیکلز کو جڑی بوٹیوں سے دوچار کرنے کے لیے بڑے پیمانے پر استعمال کیا جاتا ہے۔مختلف قسم کی جڑی بوٹی مار ادویات استعمال کرنے کی ضرورت کی وجہ سے، عمل کے نئے میکانزم کے ساتھ مرکبات کی شناخت کرنے کی ضرورت ہے۔اس مطالعے میں، ہم نے Streptomyces werraensis MK493-CF1 سے ایک ناول N -alkoxypyrrole مرکب، coumamonamide دریافت کیا اور مکمل ترکیب کا عمل قائم کیا۔حیاتیاتی سرگرمی کے جائزوں کے ذریعے، ہم نے دریافت کیا کہ urs-monoamic ایسڈ urs-monoamide کا ایک مصنوعی انٹرمیڈیٹ ہے اور ایک ممکنہپودوں کی ترقی کو روکنے والا.اس کے علاوہ، ہم نے مختلف urbenonic acid derivatives تیار کیے ہیں، بشمول urbenyloxy derivative (UDA)، جس میں HeLa خلیات کی نشوونما کو منفی طور پر متاثر کیے بغیر اعلی جڑی بوٹیوں سے متعلق سرگرمی ہوتی ہے۔ہم نے یہ بھی پایا کہ urmotonic acid کے مشتقات پودوں کے مائیکرو ٹیوبلز میں خلل ڈالتے ہیں۔اس کے علاوہ، KAND ایکٹین فلیمینٹس کو متاثر کرتا ہے اور سیل کی موت کو اکساتا ہے۔یہ کثیر جہتی اثرات معروف مائیکرو ٹیوبول انحیبیٹرز سے مختلف ہیں اور ursonic ایسڈ کے لیے کارروائی کا ایک نیا طریقہ کار تجویز کرتے ہیں، جو نئی جڑی بوٹی مار ادویات کی نشوونما میں ایک اہم فائدہ کی نمائندگی کرتا ہے۔
فائدہ مند قدرتی مصنوعات اور ان کے مشتقات کی دریافت اور عملی اطلاق انسانی زندگی کے معیار کو بہتر بنانے کا ذریعہ ہے۔مائکروجنزموں، پودوں اور کیڑوں کے ذریعہ تیار کردہ ثانوی میٹابولائٹس نے طب اور زراعت میں بڑی ترقی کی ہے۔بہت سی اینٹی بائیوٹکس اور اینٹی لیوکیمیا ادویات قدرتی مصنوعات سے تیار کی گئی ہیں۔اس کے علاوہ، مختلف اقسامکیڑے مار ادویات، فنگسائڈس اور جڑی بوٹی مار ادویات ان قدرتی مصنوعات سے زراعت میں استعمال کے لیے نکالی جاتی ہیں۔خاص طور پر، جڑی بوٹیوں پر قابو پانے والی جڑی بوٹیاں جدید زراعت میں فصل کی پیداوار بڑھانے کے لیے اہم اوزار ہیں، اور مختلف قسم کے مرکبات پہلے سے ہی تجارتی طور پر استعمال کیے جاتے ہیں۔پودوں میں کئی سیلولر عمل، جیسے فوٹو سنتھیسز، امینو ایسڈ میٹابولزم، سیل وال سنتھیسز، مائٹوسس کا ریگولیشن، فائٹو ہارمون سگنلنگ، یا پروٹین کی ترکیب، کو جڑی بوٹیوں سے دوچار کرنے کا مخصوص ہدف سمجھا جاتا ہے۔وہ مرکبات جو مائیکرو ٹیوبول کے کام کو روکتے ہیں وہ جڑی بوٹیوں کی دواؤں کا ایک عام طبقہ ہے جو مائٹوٹک ریگولیشن2 کو متاثر کرکے پودوں کی نشوونما کو متاثر کرتا ہے۔
مائکروٹوبولس سائٹوسکلٹن کے اجزاء ہیں اور یوکرائیوٹک خلیوں میں وسیع پیمانے پر محفوظ ہیں۔Tubulin heterodimer α-tubulin اور β-tubulin پر مشتمل ہوتا ہے جو لکیری مائیکرو ٹیوبول پروٹوفلامینٹس بناتا ہے، جس میں 13 پروٹوفیلمینٹس ایک بیلناکار ڈھانچہ بناتے ہیں۔مائیکرو ٹیوبولس پودوں کے خلیوں میں متعدد کردار ادا کرتے ہیں، بشمول خلیے کی شکل، خلیے کی تقسیم، اور انٹرا سیلولر ٹرانسپورٹ3,4۔پودوں کے خلیوں میں انٹرفیس پلازما جھلی کے نیچے مائکرو ٹیوبولس ہوتے ہیں، اور یہ نام نہاد کارٹیکل مائیکرو ٹیوبولس سیلولوز سنتھیس کمپلیکس 4,5 کے ضابطے کے ذریعے سیلولوز مائیکرو فائبرلز کی تنظیم کو کنٹرول کرتے ہیں۔جڑ کے ایپیڈرمل خلیوں کے کارٹیکل مائیکرو ٹیوبولس، جو جڑ کی نوک کی تیزی سے طوالت کے زون میں موجود ہوتے ہیں، بعد میں واقع ہوتے ہیں، اور سیلولوز مائیکرو فائیبر ان مائیکرو ٹیوبلز کی پیروی کرتے ہیں اور خلیے کی توسیع کی سمت کو محدود کرتے ہیں، اس طرح انیسوٹروپک سیل کی توسیع کو فروغ دیتے ہیں۔لہذا، مائیکرو ٹیوبول فنکشن کا پودوں کی مورفولوجی سے گہرا تعلق ہے۔جینز میں امینو ایسڈ کے متبادل ٹیوبلین کو انکوڈنگ کرنے سے کارٹیکل مائیکرو ٹیوبول صفوں کی ترچھی اور عربیڈوپسس 6,7 میں بائیں یا دائیں طرف بڑھنے کا سبب بنتا ہے۔اسی طرح، مائیکرو ٹیوبول سے وابستہ پروٹین میں تغیرات جو مائیکرو ٹیوبول کی حرکیات کو منظم کرتے ہیں وہ بھی مسخ شدہ جڑ کی نشوونما کا باعث بن سکتے ہیں8,9,10,11,12,13۔اس کے علاوہ، مائیکرو ٹیوبول میں خلل ڈالنے والی جڑی بوٹیوں سے متعلق ادویات جیسے کہ ڈسپیرامائیڈ، جسے پریٹیلچلور بھی کہا جاتا ہے، کے ساتھ علاج بھی بائیں طرف ترچھی جڑوں کی نشوونما کا سبب بنتا ہے۔یہ اعداد و شمار بتاتے ہیں کہ پودوں کی نشوونما کی سمت کا تعین کرنے کے لیے مائکروٹوبول فنکشن کا قطعی ضابطہ اہم ہے۔
مختلف قسم کے مائیکرو ٹیوبول انحیبیٹرز دریافت کیے گئے ہیں، اور ان ادویات نے سائٹوسکیلیٹل ریسرچ کے ساتھ ساتھ زراعت اور دوائیوں میں بھی اہم کردار ادا کیا ہے۔خاص طور پر، oryzalin، dinitroaniline مرکبات، disopyramide، benzamide سے متعلق مرکبات، اور ان کے analogs microtubule کے کام کو روک سکتے ہیں اور اس طرح پودوں کی نشوونما کو روک سکتے ہیں۔لہذا، وہ بڑے پیمانے پر جڑی بوٹیوں سے متعلق ادویات کے طور پر استعمال ہوتے ہیں.تاہم، چونکہ مائیکرو ٹیوبولس پودوں اور حیوانی خلیوں کا ایک اہم جزو ہیں، زیادہ تر مائیکرو ٹیوبول روکنے والے دونوں قسم کے خلیوں کے لیے سائٹوٹوکسک ہوتے ہیں۔لہٰذا، جڑی بوٹیوں کی دوائیوں کے طور پر ان کی تسلیم شدہ افادیت کے باوجود، محدود تعداد میں antimicrotubule ایجنٹوں کو عملی مقاصد کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔
Streptomyces خاندان Streptomyces کی ایک جینس ہے، جس میں ایروبک، گرام پازیٹو، فلیمینٹس بیکٹیریا شامل ہیں اور وسیع پیمانے پر ثانوی میٹابولائٹس کی ایک وسیع رینج پیدا کرنے کی صلاحیت کے لیے جانا جاتا ہے۔لہذا، یہ نئی حیاتیاتی طور پر فعال قدرتی مصنوعات کے سب سے اہم ذرائع میں سے ایک سمجھا جاتا ہے.موجودہ مطالعہ میں، ہم نے coumamonamide کے نام سے ایک نیا مرکب دریافت کیا، جو Streptomyces werraensis MK493-CF1 اور S. werraensis ISP 5486 سے الگ تھلگ تھا۔ سپیکٹرل تجزیہ اور مکمل سپیکٹرل تجزیہ کا استعمال کرتے ہوئے، coumamonamide کی ساخت کی خصوصیت کی گئی تھی اور اس کی منفرد N-N-N-N-N-N-N-N-N-N-SQL. طے کیا گیا تھا.ترکیبUrsmonic acid، ursmonoamide اور اس کے مشتق کا ایک مصنوعی انٹرمیڈیٹ، مقبول ماڈل پلانٹ Arabidopsis thaliana کی نشوونما اور انکرن کو روکتا پایا گیا۔ڈھانچے اور سرگرمی کے تعلق کے مطالعے میں، ہم نے پایا کہ C9 کے ساتھ ایک مرکب جسے ursonic ایسڈ میں تبدیل کیا گیا ہے، جسے nonyloxy derivative of ursonic acid (KAND) کہا جاتا ہے، نمو اور انکرن پر روکنے والے اثر کو نمایاں طور پر بڑھاتا ہے۔خاص طور پر، نئے دریافت شدہ پودوں کی نشوونما کو روکنے والے نے تمباکو اور جگر کی نشوونما کو بھی متاثر کیا اور یہ بیکٹیریا یا ہیلا کے خلیوں کے لیے سائٹوٹوکسک نہیں تھا۔مزید برآں، کچھ urmotonic acid مشتق ایک مسخ شدہ جڑ فینوٹائپ کو جنم دیتے ہیں، جس کا مطلب یہ ہے کہ یہ مشتق براہ راست یا بالواسطہ طور پر مائیکرو ٹیوبلز کو متاثر کرتے ہیں۔اس خیال سے مطابقت رکھتے ہوئے، امیونو ہسٹو کیمیکل یا فلوروسینٹ پروٹین کے ساتھ لیبل لگائے گئے مائیکرو ٹیوبلز کے ہمارے مشاہدات اس بات کی نشاندہی کرتے ہیں کہ KAND علاج مائیکرو ٹیوبولس کو ڈیپولیمرائز کرتا ہے۔اس کے علاوہ، کماموٹونک ایسڈ ڈیریویٹوز کے ساتھ علاج نے ایکٹین مائیکرو فیلامینٹس میں خلل ڈالا۔اس طرح، ہم نے پودوں کی نشوونما کو روکنے والا ایک نیا دریافت کیا ہے جس کے عمل کے منفرد طریقہ کار میں سائٹوسکلٹن کی تباہی شامل ہے۔
MK493-CF1 تناؤ کو شیناگاوا، ٹوکیو میں مٹی سے الگ تھلگ کیا گیا تھا۔تناؤ MK493-CF1 اچھی طرح سے شاخوں والا اسٹروومل مائیسیلیم تشکیل دیتا ہے۔16S رائبوسومل RNA جین (1422 bp) کی جزوی ترتیب کا تعین کیا گیا تھا۔یہ تناؤ S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: عام تناؤ، 99.93%) سے بہت ملتا جلتا ہے۔اس نتیجے کی بنیاد پر، یہ طے پایا کہ اس تناؤ کا S. werraensis کی قسم کے تناؤ سے گہرا تعلق تھا۔لہذا، ہم نے عارضی طور پر اس تناؤ کا نام S. werraensis MK493-CF1 رکھا ہے۔S. werraensis ISP 5486T بھی وہی بایو ایکٹیو مرکبات تیار کرتا ہے۔چونکہ اس مائکروجنزم سے قدرتی مصنوعات حاصل کرنے کے بارے میں ابتدائی تحقیق نہیں ہوئی تھی، اس لیے مزید کیمیائی تحقیق کی گئی۔S. werraensis MK493-CF1 کو جو کے درمیانے درجے پر ٹھوس حالت کے ابال کے ذریعے 30°C پر 14 دنوں تک کاشت کرنے کے بعد، میڈیم کو 50% EtOH کے ساتھ نکالا گیا۔59.5 ملی گرام خام عرق حاصل کرنے کے لیے 60 ملی لیٹر نمونہ خشک کیا گیا تھا۔N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1، جس کا نام coumamonamide، 36.0 mg ہے) دینے کے لیے خام عرق کو ریورس فیز HPLC کا نشانہ بنایا گیا۔1 کی کل مقدار خام نکالنے کا تقریباً 60% ہے۔لہذا، ہم نے kumamotoamide 1 کی خصوصیات کا تفصیل سے مطالعہ کرنے کا فیصلہ کیا۔
Coumamonamide 1 ایک سفید بے ساختہ پاؤڈر ہے اور ہائی ریزولوشن ماس سپیکٹرو میٹری (HRESIMS) C6H8N2O2 (تصویر 1) کی تصدیق کرتا ہے۔اس کمپاؤنڈ کا C2-متبادل پائرول ٹکڑا δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH 1H NMR سپیکٹرم میں: 4.5 Hz , H-5) اور δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6)، اور 13C NMR سپیکٹرم چار sp2 کاربن ایٹموں کی موجودگی کو ظاہر کرتا ہے۔C2 پوزیشن پر امائڈ گروپ کی موجودگی کا اندازہ C-3 پروٹون سے امائڈ کاربونیل کاربن سے δC 161.1 پر HMBC کے ارتباط سے لگایا گیا۔مزید برآں، δH 4.10 (3H, S) اور δC 68.3 پر 1 H اور 13 C NMR چوٹیوں سے مالیکیول میں N-methoxy گروپس کی موجودگی کی نشاندہی ہوتی ہے۔اگرچہ میتھوکسی گروپ کی صحیح پوزیشن ابھی تک اسپیکٹروسکوپک تجزیہ جیسے بہتر فرق اسپیکٹروسکوپی اور نیوکلیئر اوور ہاؤسر مخفف (NOEDF) کے استعمال سے طے نہیں کی گئی تھی، N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide پہلا امیدوار مرکب بن گیا۔
1 کی صحیح ساخت کا تعین کرنے کے لیے، کل ترکیب کی گئی (تصویر 2a)۔تجارتی طور پر دستیاب 2-aminopyridine 2 کے m-CPBA کے ساتھ علاج کے نتیجے میں اسی N-oxide 3 کو مقداری پیداوار حاصل ہوئی۔2 کے 2-امینوآزیڈیشن کے بعد، ابراموچ کے ذریعہ بیان کردہ سائکلوکنڈنسیشن رد عمل کو بینزین میں 90 ° C پر کیا گیا تاکہ مطلوبہ 1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile 5 گرام میں حاصل کیا جا سکے۔رفتار 60٪ (دو مراحل)۔15,16۔4 کے میتھیلیشن اور ہائیڈولیسس نے پھر اچھی پیداوار میں 1-میتھوکسی-1 ایچ-پائرول-2-کاربو آکسیلک ایسڈ (جسے "کموٹونک ایسڈ" کہا جاتا ہے، 6) دیا (70%، دو قدم)۔آخر میں، تیزابی امونیا کا استعمال کرتے ہوئے ایسڈ کلورائیڈ انٹرمیڈیٹ 6 کے ذریعے امیڈیشن نے کماموٹو امائیڈ 1 کو 98 فیصد پیداوار میں دیا۔ترکیب شدہ 1 کے تمام سپیکٹرل ڈیٹا الگ تھلگ 1 سے ملتے جلتے تھے، لہذا 1 کی ساخت کا تعین کیا گیا تھا۔
urbenamide اور urbenic acid کی حیاتیاتی سرگرمی کا عمومی ترکیب اور تجزیہ۔(a) Kumamoto amide کی کل ترکیب۔(b) سات دن پرانے جنگلی قسم کے عربیڈوپسس کولمبیا (کرنل) کے پودے مراشیج اور اسکوگ (ایم ایس) پلیٹوں پر اگائے گئے تھے جن میں کومامونامائڈ 6 یا کومامونامائڈ 1 اشارہ کیا گیا تھا۔اسکیل بار = 1 سینٹی میٹر۔
سب سے پہلے، ہم نے پودوں کی نشوونما میں ترمیم کرنے کی صلاحیت کے لیے urbenamide اور اس کے انٹرمیڈیٹس کی حیاتیاتی سرگرمیوں کا اندازہ کیا۔ہم نے ایم ایس ایگر میڈیم میں ursmonamide 1 یا ursmonic acid 6 کی مختلف مقداریں شامل کیں اور اس میڈیم پر کلچرڈ Arabidopsis thaliana seedlings۔ان پرکھوں نے ظاہر کیا کہ 6 کی زیادہ تعداد (500 μM) جڑ کی نشوونما کو روکتی ہے (تصویر 2b)۔اس کے بعد، ہم نے 6 کی N1 پوزیشن کو بدل کر مختلف مشتقات تیار کیں اور ان پر ڈھانچہ – ایکٹیویٹی ریلیشن شپ اسٹڈیز کیں (انالاگ ترکیب کے عمل کو معاون معلومات (SI) میں بیان کیا گیا ہے)۔Arabidopsis seedlings 50 μM ursonic acid derivatives پر مشتمل میڈیم پر اگائے گئے تھے، اور جڑ کی لمبائی کی پیمائش کی گئی تھی۔جیسا کہ تصویر میں دکھایا گیا ہے۔جیسا کہ اعداد و شمار 3a، b، اور S1 میں دکھایا گیا ہے، coumamo acids میں N1 پوزیشن پر لکیری الکوکسی چینز (9، 10، 11، 12، اور 13) یا بڑی الکوکسی چینز (15، 16، اور 17) کی لمبائی مختلف ہوتی ہے۔مشتقات نے جڑوں کی نشوونما میں نمایاں رکاوٹ ظاہر کی۔اس کے علاوہ، ہم نے پایا کہ 200 μM 10، 11، یا 17 کا اطلاق انکرن کو روکتا ہے (تصویر 3c اور S2)۔
کماموٹو امائیڈ اور متعلقہ مرکبات کے ساخت اور سرگرمی کے تعلق کا مطالعہ۔(a) ینالاگس کی ساخت اور ترکیب اسکیم۔(b) MS میڈیم پر 50 μM coumamonamide مشتقات کے ساتھ یا اس کے بغیر اگائے گئے 7 دن پرانے پودوں کی جڑ کی لمبائی کی مقدار۔نجمہ شرم کے علاج کے ساتھ اہم فرق کی نشاندہی کرتا ہے (ٹی ٹیسٹ، پی<0.05)۔n>18. ڈیٹا کو اوسط ± SD کے طور پر دکھایا گیا ہے۔nt کا مطلب ہے "ٹیسٹ نہیں کیا گیا" کیونکہ 50% سے زیادہ بیج اگے نہیں تھے۔(c) 200 μM coumamonamide اور متعلقہ مرکبات کے ساتھ یا اس کے بغیر MS میڈیم میں 7 دن تک علاج شدہ بیجوں کے انکرن کی شرح کی مقدار کا تعین۔ستارے شرم کے علاج (چی مربع ٹیسٹ) کے ساتھ اہم فرق کی نشاندہی کرتے ہیں۔n=96۔
دلچسپ بات یہ ہے کہ C9 سے زیادہ لمبی الکائل سائیڈ چینز کے اضافے نے روکی ہوئی سرگرمی کو کم کر دیا، یہ تجویز کرتا ہے کہ کماموٹوک ایسڈ سے متعلق مرکبات کو اپنی حیاتیاتی سرگرمی کو ظاہر کرنے کے لیے ایک خاص سائز کی سائیڈ چینز کی ضرورت ہوتی ہے۔
چونکہ ساخت اور سرگرمی کے تعلقات کے تجزیے سے پتہ چلتا ہے کہ C9 کو ursonic ایسڈ میں تبدیل کیا گیا تھا اور ursonic ایسڈ (اس کے بعد KAND 11 کے نام سے جانا جاتا ہے) کا نونائیلوکسی ماخوذ پودوں کی نشوونما کو روکنے والا سب سے مؤثر تھا، اس لیے ہم نے KAND 11 کی مزید تفصیلی خصوصیات کا جائزہ لیا۔ Arabidopsis کا علاج 50 μM کے ساتھ KAND 11 نے انکرن کو تقریباً مکمل طور پر روک دیا، جبکہ KAND 11 کی کم ارتکاز (40, 30, 20, یا 10 μM) خوراک پر منحصر انداز میں جڑوں کی نشوونما کو روکتی ہے (تصویر 4a, b)۔یہ جانچنے کے لیے کہ آیا KAND 11 روٹ meristem کی قابل عملیت کو متاثر کرتا ہے، ہم نے پروپیڈیم آئوڈائڈ (PI) سے داغے ہوئے جڑوں کے میریسٹیمز کا معائنہ کیا اور میریسٹیم کے علاقے کے سائز کی پیمائش کی۔25 μM KAND-11 پر مشتمل درمیانے درجے پر اگائے جانے والے پودوں کے میرسٹیم کا سائز 151.1 ± 32.5 μm تھا، جب کہ DMSO پر مشتمل کنٹرول میڈیم پر اگائے جانے والے پودوں کے میرسٹیم کا سائز 264.7 ± 30.8 μc،4m (4) ، جو اس بات کی نشاندہی کرتا ہے کہ KAND-11 سیلولر سرگرمی کو بحال کرتا ہے۔پھیلاناجڑ مرسٹیم.اس کے ساتھ مطابقت رکھتے ہوئے، KAND 11 کے علاج نے سیل ڈویژن مارکر CDKB2؛ 1p::CDKB2؛ 1-GUS سگنل کی روٹ میریسٹیم (تصویر 4e) 17 میں کمی کردی۔یہ نتائج بتاتے ہیں کہ KAND 11 خلیوں کے پھیلاؤ کی سرگرمی کو کم کرکے جڑوں کی نشوونما کو روکتا ہے۔
ترقی پر urbenonic ایسڈ مشتقات (urbenyloxy derivatives) کے روکنے والے اثر کا تجزیہ۔(a) 7 دن پرانے جنگلی قسم کے Col seedlings MS پلیٹوں پر اگائے گئے جن میں KAND 11 کی نشاندہی کی گئی ہے۔ اسکیل بار = 1 سینٹی میٹر۔(b) جڑ کی لمبائی کی مقدار۔خطوط اہم اختلافات کی نشاندہی کرتے ہیں (Tukey HSD ٹیسٹ، p<0.05)۔n>16. ڈیٹا کو اوسط ± SD کے طور پر دکھایا گیا ہے۔(c) 25 μM کینڈ 11 کے ساتھ یا اس کے بغیر MS پلیٹوں پر اگنے والی پروپیڈیم آئوڈائڈ سے داغدار جنگلی قسم کی کول جڑوں کی کنفوکل مائیکروسکوپی۔اسکیل بار = 100 µm۔(d) روٹ میرسٹیم سائز کی مقدار (n = 10 سے 11)۔شماریاتی اختلافات کا تعین t-ٹیسٹ (p<0.05)۔سلاخیں اوسط meristem سائز کی نمائندگی کرتی ہیں۔(e) CDKB2 کنسٹرکٹ پر مشتمل روٹ میرسٹم کی ڈیفرینشل انٹرفیس کنٹراسٹ (DIC) مائکروسکوپی؛1pro: CDKB2;1-GUS 25 µM KAND پرکھ کے ساتھ یا اس کے بغیر MS پلیٹوں پر اگائے جانے والے 5 دن پرانے پودوں پر داغ دار اور داغدار۔
KAND 11 کی phytotoxicity کا مزید تجربہ ایک اور dicotyledonous plant، تمباکو (Nicotiana tabacum)، اور ایک بڑے زمینی پلانٹ کے نمونے، لیورورٹ (Marchantia polymorpha) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔جیسا کہ Arabidopsis کے معاملے میں، تمباکو کے SR-1 کے پودے درمیانے درجے پر اگائے گئے جن میں 25 μM KAND 11 کی جڑیں چھوٹی ہوتی ہیں (تصویر 5a)۔مزید برآں، 48 میں سے 40 بیج 200 μM KAND 11 پر مشتمل پلیٹوں پر اُگ آئے، جبکہ تمام 48 بیج فرضی علاج شدہ میڈیا پر اُگ آئے، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ KAND کی زیادہ تعداد نمایاں تھی (p<0.05؛chi test -square) تمباکو کے انکرن کو روکتا ہے۔(تصویر 5 بی)۔اس کے علاوہ، KAND 11 کا ارتکاز جو جگر کے ورٹ میں بیکٹیریا کی نشوونما کو روکتا ہے، عربیڈوپسس (تصویر 5c) میں موثر ارتکاز کی طرح تھا۔یہ نتائج بتاتے ہیں کہ KAND 11 مختلف قسم کے پودوں کی نشوونما کو روک سکتا ہے۔اس کے بعد ہم نے بالترتیب اعلی جانوروں اور بیکٹیریل خلیوں کے نمائندوں کے طور پر دوسرے جانداروں، یعنی انسانی HeLa خلیات اور Escherichia coli strain DH5α میں ریچھ کے مونوامائڈ سے متعلق مرکبات کی ممکنہ سائٹوٹوکسیٹی کی تحقیقات کی۔خلیوں کے پھیلاؤ کی جانچ کی ایک سیریز میں، ہم نے مشاہدہ کیا کہ coumamonamide 1، coumamonamidic acid 6، اور KAND 11 نے 100 μM (تصویر 5d،e) کے ارتکاز پر HeLa یا E. coli خلیوں کی نشوونما کو متاثر نہیں کیا۔
غیر عربیڈوپسس جانداروں میں KAND 11 کی نشوونما کی روک تھام۔(a) دو ہفتے پرانے جنگلی قسم کے SR-1 تمباکو کے پودے عمودی پوزیشن پر MS پلیٹوں پر اگائے گئے جن میں 25 μM KAND 11 شامل تھے۔ MS پلیٹیں جن میں 200 μM KAND 11 ہے۔ (c) دو ہفتے پرانی جنگلی قسم کی Tak-1 لیورورٹ کلیاں جو گیمبورگ B5 پلیٹوں پر کینڈی 11 کی نشاندہی شدہ تعداد کے ساتھ اگائی جاتی ہیں۔ سرخ تیر ان بیضوں کی نشاندہی کرتے ہیں جو دو ہفتوں کے انکیوبیشن کے اندر بڑھنا بند کر دیتے ہیں۔ مدت(d) HeLa خلیوں کے سیل پھیلاؤ پرکھ۔قابل عمل خلیوں کی تعداد کو سیل گنتی کٹ 8 (ڈوجنڈو) کا استعمال کرتے ہوئے مقررہ وقت کے وقفوں پر ماپا گیا۔ایک کنٹرول کے طور پر، HeLa خلیوں کا علاج 5 μg/ml actinomycin D (Act D) سے کیا گیا، جو RNA پولیمریز ٹرانسکرپشن کو روکتا ہے اور سیل کی موت کا سبب بنتا ہے۔تجزیے سہ رخی میں کیے گئے۔(e) ای کولی سیل پھیلاؤ پرکھ۔ای کولی کی نمو کا تجزیہ OD600 کی پیمائش کرکے کیا گیا۔ایک کنٹرول کے طور پر، خلیوں کا علاج 50 μg/ml ampicillin (Amp) سے کیا گیا، جو کہ بیکٹیریل سیل وال کی ترکیب کو روکتا ہے۔تجزیے سہ رخی میں کیے گئے۔
یورامائڈ سے متعلق مرکبات کی وجہ سے سائٹوٹوکسائٹی کے عمل کے طریقہ کار کو سمجھنے کے لیے، ہم نے معتدل روکنے والے اثرات کے ساتھ urbenic ایسڈ مشتقات کا دوبارہ تجزیہ کیا۔جیسا کہ تصویر میں دکھایا گیا ہے۔جیسا کہ اعداد و شمار 2b، 6a میں دکھایا گیا ہے، urmotonic ایسڈ 6 کی زیادہ ارتکاز (200 μM) پر مشتمل آگر پلیٹوں پر اگائے جانے والے پودوں نے چھوٹی اور بائیں مڑے ہوئے جڑیں (θ = – 23.7 ± 6.1) پیدا کی ہیں، جبکہ کنٹرول میڈیم پر اگنے والی پودوں کی پودوں سے تقریباً سیدھی جڑیں پیدا ہوتی ہیں (θ = – 3.8 ± 7.1)۔یہ خصوصیت ترچھی نشوونما کارٹیکل مائکروٹوبولس 14,18 کے غیر فعال ہونے کے نتیجے میں جانا جاتا ہے۔اس کھوج سے ہم آہنگ، مائیکرو ٹیوبول کو غیر مستحکم کرنے والی دوائیں ڈسپیرامائیڈ اور اوریزالین نے ہماری نشوونما کے حالات میں جڑوں کو اسی طرح کی جھکاؤ پیدا کیا (تصویر 2b، 6a)۔ایک ہی وقت میں، ہم نے urmotonic acid مشتقات کا تجربہ کیا اور ان میں سے کئی کو منتخب کیا جو کہ مخصوص ارتکاز میں، ترچھی جڑوں کی نشوونما کو متاثر کرتے ہیں۔مرکبات 8، 9، اور 15 نے بالترتیب 75 μM، 50 μM، اور 40 μM پر جڑوں کی نشوونما کی سمت کو تبدیل کیا، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ یہ مرکبات مائیکرو ٹیوبلز کو مؤثر طریقے سے غیر مستحکم کر سکتے ہیں (تصویر 2b، 6a)۔ہم نے کم ارتکاز (15 µM) میں سب سے زیادہ طاقتور ursolic ایسڈ ڈیریویٹیو، KAND 11 کا بھی تجربہ کیا اور پایا کہ KAND 11 کے استعمال سے جڑوں کی نشوونما کو روکا جاتا ہے اور یہ کہ جڑوں کی نشوونما کی سمت غیر مساوی تھی، حالانکہ وہ بائیں طرف ڈھلوان ہوتے تھے ( شکل C3)۔.چونکہ مائیکرو ٹیوبول کو غیر مستحکم کرنے والی دوائیوں کی زیادہ تعداد بعض اوقات جڑ کے جھکاؤ کا سبب بننے کے بجائے پودوں کی نشوونما کو روکتی ہے، اس لیے ہم نے بعد میں اس امکان کا اندازہ لگایا کہ KAND 11 جڑ کے ایپیڈرمل خلیوں میں کارٹیکل مائیکرو ٹیوبولس کا مشاہدہ کر کے مائیکرو ٹیوبلز کو متاثر کرتا ہے۔25 μM کینڈ 11 کے ساتھ علاج شدہ بیج کی جڑوں کے ایپیڈرمل خلیوں میں اینٹی β-ٹیوبلین اینٹی باڈیز کا استعمال کرتے ہوئے امیونو ہسٹو کیمسٹری نے بڑھاو والے زون (تصویر 6b) میں ایپیڈرمل خلیوں میں تقریبا تمام کارٹیکل مائکروٹوبولس کے غائب ہونے کو ظاہر کیا۔یہ نتائج بتاتے ہیں کہ کماموٹونک ایسڈ اور اس کے مشتق مائکروٹیوبلز پر براہ راست یا بالواسطہ طور پر کام کرتے ہیں تاکہ ان میں خلل ڈالا جا سکے اور یہ مرکبات نوول مائکروٹیوبول انحیبیٹرز ہیں۔
ارسونک ایسڈ اور اس کے مشتقات عربیڈوپسس تھالیانا میں کارٹیکل مائکروٹوبولس کو تبدیل کرتے ہیں۔(a) جڑ کے جھکاؤ کا زاویہ اشارہ شدہ ارتکاز پر مختلف urmotonic ایسڈ مشتقات کی موجودگی میں ماپا جاتا ہے۔دو مرکبات کے اثرات جو مائیکرو ٹیوبلز کو روکنے کے لیے جانا جاتا ہے: ڈسپیرامائیڈ اور اوریزالین کا بھی تجزیہ کیا گیا۔انسیٹ جڑ کے بڑھنے کے زاویہ کی پیمائش کے لیے استعمال ہونے والے معیار کو ظاہر کرتا ہے۔نجمہ شرم کے علاج کے ساتھ اہم فرق کی نشاندہی کرتا ہے (ٹی ٹیسٹ، پی<0.05)۔n>19. اسکیل بار = 1 سینٹی میٹر۔(b) لمبا زون میں ایپیڈرمل خلیوں میں کارٹیکل مائکروٹوبولس۔25 μM KAND 11 کے ساتھ یا اس کے بغیر MS پلیٹوں پر اگنے والی جنگلی قسم کے Arabidopsis Col جڑوں میں مائکروٹوبولس کو β-tubulin پرائمری اینٹی باڈیز اور Alexa Fluor-conjugated سیکنڈری اینٹی باڈیز کا استعمال کرتے ہوئے امیونو ہسٹو کیمیکل سٹیننگ کے ذریعے تصور کیا گیا تھا۔اسکیل بار = 10 µm۔(c) جڑ کے مرسٹیم میں مائکروٹوبولس کی مائٹوٹک ساخت۔امیونو ہسٹو کیمیکل سٹیننگ کا استعمال کرتے ہوئے مائکروٹوبولس کا تصور کیا گیا تھا۔مائٹوٹک ڈھانچے، بشمول پروفیس زون، اسپنڈلز، اور فریگموپلاسٹ، کو کنفوکل امیجز سے شمار کیا گیا تھا۔تیر مائٹوٹک مائکروٹوبول ڈھانچے کی نشاندہی کرتے ہیں۔نجمہ شرم کے علاج کے ساتھ اہم فرق کی نشاندہی کرتا ہے (ٹی ٹیسٹ، پی<0.05)۔n>9. اسکیل بار = 50 µm۔
اگرچہ ارسا میں مائیکرو ٹیوبول فنکشن میں خلل ڈالنے کی صلاحیت ہے، لیکن اس کے عمل کا طریقہ کار عام مائیکرو ٹیوبول ڈیپولیمرائزنگ ایجنٹوں سے مختلف ہونے کی توقع ہے۔مثال کے طور پر، مائیکرو ٹیوبول ڈیپولیمرائزنگ ایجنٹوں کی زیادہ تعداد جیسے ڈسپو پیرامائڈ اور اوریزالین ایپیڈرمل خلیوں کی انیسوٹروپک توسیع کو اکساتے ہیں، جبکہ KAND 11 ایسا نہیں کرتا ہے۔اس کے علاوہ، KAND 11 اور disopyramide کے مشترکہ استعمال کے نتیجے میں مشترکہ disopyramide-حوصلہ افزائی جڑ کی ترقی کا ردعمل اور KAND 11-حوصلہ افزائی ترقی کی روک تھام کا مشاہدہ کیا گیا تھا (تصویر S4)۔ہم نے KAND 11 کے لیے hypersensitive disopyramide 1-1 (phs1-1) اتپریورتی کے ردعمل کا بھی تجزیہ کیا۔ phs1-1 میں غیر کینونیکل ٹیوبلین کناز پوائنٹ میوٹیشن ہے اور جب ڈسپو پیرامائیڈ 9,20 کے ساتھ علاج کیا جاتا ہے تو اس کی جڑیں چھوٹی ہوتی ہیں۔کینڈ 11 پر مشتمل آگر میڈیم پر اگائے جانے والے phs1-1 اتپریورتی پودوں کی جڑیں ڈسپوپرامڈ (تصویر S5) پر اگنے والی جڑوں کی طرح چھوٹی ہوتی ہیں۔
اس کے علاوہ، ہم نے KAND 11 کے ساتھ علاج کیے جانے والے بیجوں کی جڑوں کے مرسٹیم میں مائٹوٹک مائیکرو ٹیوبول ڈھانچے، جیسے پروفیس زون، اسپنڈلز، اور فریگموپلاسٹ کا مشاہدہ کیا۔ mitotic microtubules کی تعداد دیکھی گئی (تصویر .6c)۔
سب سیلولر ریزولوشن میں KAND 11 کی سائٹوٹوکسیٹی کو نمایاں کرنے کے لیے، ہم نے KAND 11 کے ساتھ تمباکو BY-2 معطلی خلیوں کا علاج کیا اور ان کے ردعمل کا مشاہدہ کیا۔ہم نے سب سے پہلے KAND 11 کو BY-2 خلیوں میں شامل کیا جو TagRFP-TUA6 کا اظہار کرتے ہیں، جو فلوروسینٹ طور پر مائکرو ٹیوبلز کا لیبل لگاتے ہیں، تاکہ کارٹیکل مائکرو ٹیوبولس پر KAND 11 کے اثر کا اندازہ لگایا جا سکے۔کارٹیکل مائکروٹوبول کثافت کا اندازہ تصویری تجزیہ کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا، جس نے سائٹوپلاسمک پکسلز کے درمیان سائٹوسکیلیٹل پکسلز کے فیصد کی مقدار درست کی تھی۔پرکھ کے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ 50 μM یا 100 μM KAND 11 کے ساتھ 1 گھنٹے تک علاج کرنے کے بعد، کثافت بالترتیب 0.94 ± 0.74% یا 0.23 ± 0.28% تک کم ہو گئی، جبکہ DMSO کے ساتھ علاج کیے جانے والے خلیوں کی کثافت ± 1.4 ± 1.6 ہو گئی۔ % (تصویر 7a)۔یہ نتائج عربیڈوپسس کے مشاہدے کے ساتھ مطابقت رکھتے ہیں کہ KAND 11 کا علاج کارٹیکل مائکروٹوبولس (تصویر 6b) کی ڈیپولیمرائزیشن کو اکساتا ہے۔ہم نے KAND 11 کے اسی ارتکاز کے ساتھ علاج کے بعد GFP-ABD کے لیبل والے ایکٹین فلیمینٹس کے ساتھ BY-2 لائن کا بھی معائنہ کیا اور مشاہدہ کیا کہ KAND 11 کے علاج نے ایکٹین فلیمینٹس میں خلل ڈالا۔1 گھنٹہ کے لیے 50 μM یا 100 μM KAND 11 کے ساتھ علاج نے بالترتیب 1.20 ± 0.62% یا 0.61 ± 0.26% تک ایکٹین فلیمینٹ کی کثافت کو نمایاں طور پر کم کر دیا، جب کہ DMSO سے علاج کیے جانے والے خلیوں میں کثافت 1.69 %F ± 0.5 ± 1.69 تھی۔7b)۔یہ نتائج پروپیزامائیڈ کے اثرات سے متصادم ہیں، جو ایکٹین فلامینٹ کو متاثر نہیں کرتا ہے، اور لیٹرنکولن بی، ایک ایکٹین ڈیپولیمرائزر جو مائیکرو ٹیوبلز (SI Figure S6) کو متاثر نہیں کرتا ہے۔اس کے علاوہ، coumamonamide 1، coumamonamide acid 6، یا KAND 11 کے ساتھ علاج سے HeLa خلیات (SI Figure S7) میں مائیکرو ٹیوبولس متاثر نہیں ہوئے۔اس طرح، KAND 11 کی کارروائی کا طریقہ کار معروف سائٹوسکلٹن ڈسپرٹرز سے مختلف سمجھا جاتا ہے۔اس کے علاوہ، KAND 11 کے ساتھ علاج کیے گئے BY-2 خلیوں کے ہمارے خوردبینی مشاہدے سے KAND 11 کے علاج کے دوران خلیوں کی موت کے آغاز کا انکشاف ہوا اور یہ ظاہر ہوا کہ KAND 11 کے علاج کے 30 منٹ کے بعد ایونز کے نیلے داغ والے مردہ خلیوں کے تناسب میں کوئی خاص اضافہ نہیں ہوا، جبکہ 50 μM یا 100 μM KAND کے ساتھ علاج کے 90 منٹ کے بعد، مردہ خلیوں کی تعداد بالترتیب 43.7% یا 80.1% تک بڑھ گئی (تصویر 7c)۔ایک ساتھ لیا جائے تو، یہ اعداد و شمار بتاتے ہیں کہ ناول ursolic acid derivative KAND 11 ایک پلانٹ کے لیے مخصوص سائٹوسکیلیٹل انحیبیٹر ہے جس کی کارروائی کا پہلے سے نامعلوم طریقہ کار ہے۔
KAND cortical microtubules، actin filaments، اور تمباکو BY-2 خلیوں کی عملداری کو متاثر کرتا ہے۔(a) TagRFP-TUA6 کی موجودگی میں BY-2 خلیوں میں کارٹیکل مائکروٹوبولس کا تصور۔KAND 11 (50 μM یا 100 μM) یا DMSO کے ساتھ علاج کیے جانے والے BY-2 خلیوں کی جانچ کنفوکل مائکروسکوپی کے ذریعے کی گئی۔کارٹیکل مائکروٹوبول کثافت کا حساب 25 آزاد خلیوں کے مائکرو گراف سے کیا گیا تھا۔خطوط اہم اختلافات کی نشاندہی کرتے ہیں (Tukey HSD ٹیسٹ، p<0.05)۔اسکیل بار = 10 µm۔(b) BY-2 خلیوں میں Cortical actin filaments جو GFP-ABD2 کی موجودگی میں تصور کیا جاتا ہے۔KAND 11 (50 μM یا 100 μM) یا DMSO کے ساتھ علاج کیے جانے والے BY-2 خلیوں کی جانچ کنفوکل مائکروسکوپی کے ذریعے کی گئی۔کارٹیکل ایکٹین فلیمینٹس کی کثافت کا حساب 25 آزاد خلیوں کے مائکروگراف سے کیا گیا تھا۔خطوط اہم اختلافات کی نشاندہی کرتے ہیں (Tukey HSD ٹیسٹ، p<0.05)۔اسکیل بار = 10 µm۔(c) ایونز بلیو سٹیننگ کے ذریعے مردہ BY-2 خلیوں کا مشاہدہ۔KAND 11 (50 μM یا 100 μM) یا DMSO کے ساتھ علاج کیے جانے والے BY-2 خلیوں کو روشن فیلڈ مائکروسکوپی کے ذریعے جانچا گیا۔n=3۔اسکیل بار = 100 µm۔
نئی قدرتی مصنوعات کی دریافت اور اطلاق نے انسانی زندگی کے مختلف پہلوؤں بشمول طب اور زراعت میں نمایاں ترقی کی ہے۔قدرتی وسائل سے مفید مرکبات حاصل کرنے کے لیے تاریخی تحقیق کی گئی ہے۔خاص طور پر، ایکٹینومیسیٹس کو مختلف ثانوی میٹابولائٹس جیسے ایورمیکٹین، آئیورمیکٹین اور بلیومائسن کا لیڈ کمپاؤنڈ اور اس کے مشتقات پیدا کرنے کی صلاحیت کی وجہ سے نیماٹوڈس کے لیے اینٹی پراسائٹک اینٹی بائیوٹکس کے طور پر مفید جانا جاتا ہے، جو دواؤں کے طور پر اینٹی کینسر ایجنٹ 21,22 کے طور پر استعمال ہوتے ہیں۔اسی طرح ایکٹینومائسیٹس سے کئی قسم کے جڑی بوٹی مار مرکبات دریافت ہوئے ہیں، جن میں سے کچھ پہلے ہی تجارتی طور پر 1,23 استعمال ہو رہے ہیں۔لہذا، مطلوبہ حیاتیاتی سرگرمیوں کے ساتھ قدرتی مصنوعات کو الگ تھلگ کرنے کے لیے ایکٹینومیسیٹی میٹابولائٹس کا تجزیہ ایک مؤثر حکمت عملی سمجھا جاتا ہے۔اس مطالعہ میں، ہم نے S. werraensis سے ایک نیا مرکب، coumamonamide دریافت کیا اور کامیابی سے اس کی ترکیب کی۔Ursonic ایسڈ urbenamide اور اس کے مشتقات کا ایک مصنوعی انٹرمیڈیٹ ہے۔یہ خصوصیت سے جڑوں کے کرلنگ کا سبب بن سکتا ہے، اعتدال سے لے کر مضبوط جڑی بوٹیوں سے متعلق سرگرمی کا مظاہرہ کرتا ہے، اور پودوں کے مائکرو ٹیوبلز کو براہ راست یا بالواسطہ نقصان پہنچا سکتا ہے۔تاہم، urmotonic ایسڈ کے عمل کا طریقہ کار موجودہ مائیکرو ٹیوبول انحیبیٹرز سے مختلف ہو سکتا ہے، کیونکہ KAND 11 ایکٹین فلامینٹس میں بھی خلل ڈالتا ہے اور خلیے کی موت کا سبب بنتا ہے، ایک ریگولیٹری طریقہ کار تجویز کرتا ہے جس کے ذریعے urmotonic ایسڈ اور اس کے مشتق سائٹوسکیلیٹل ڈھانچے کی ایک وسیع رینج کو متاثر کرتے ہیں۔.
urbenonic acid کی مزید تفصیلی خصوصیات urbenonic ایسڈ کے عمل کے طریقہ کار کو بہتر طور پر سمجھنے میں مدد کرے گی۔خاص طور پر، اگلا مقصد ursonic ایسڈ کی کم مائیکرو ٹیوبلز سے منسلک ہونے کی صلاحیت کا اندازہ لگانا ہے تاکہ یہ تعین کیا جا سکے کہ آیا ursonic ایسڈ اور اس کے مشتق براہ راست مائیکرو ٹیوبلز پر کام کرتے ہیں اور ان کو ڈی پولیمرائز کرتے ہیں، یا ان کے عمل کے نتیجے میں مائکرو ٹیوبول عدم استحکام پیدا ہوتا ہے۔اس کے علاوہ، ایسی صورت میں جہاں مائیکرو ٹیوبولس براہ راست ہدف نہیں ہیں، پودوں کے خلیات پر کارروائی کی جگہ اور ursonic ایسڈ کے مالیکیولر اہداف کی نشاندہی کرنے سے متعلقہ مرکبات کی خصوصیات اور جڑی بوٹیوں سے متعلق سرگرمی کو بہتر بنانے کے ممکنہ طریقوں کو مزید سمجھنے میں مدد ملے گی۔ہمارے بائیو ایکٹیویٹی پرکھ نے پودوں کی نشوونما پر ursonic ایسڈ کی منفرد سائٹوٹوکسک صلاحیت کا انکشاف کیا جیسے Arabidopsis thaliana، تمباکو اور جگر ورٹ، جبکہ نہ تو E. coli اور نہ ہی HeLa خلیات متاثر ہوئے۔جانوروں کے خلیوں کے لیے بہت کم یا کوئی زہریلا ہونا ursonic ایسڈ ڈیریویٹیوز کا فائدہ ہے اگر انہیں کھلے زرعی کھیتوں میں استعمال کے لیے جڑی بوٹیوں سے دوچار کرنے کے لیے تیار کیا جائے۔درحقیقت، چونکہ مائیکرو ٹیوبولس یوکرائٹس میں عام ڈھانچے ہیں، اس لیے پودوں میں ان کی منتخب روکنا جڑی بوٹیوں سے دوچار ہونے کی کلیدی ضرورت ہے۔مثال کے طور پر، پروپیزامائیڈ، ایک مائیکرو ٹیوبول ڈیپولیمرائزنگ ایجنٹ جو براہ راست ٹیوبلین سے منسلک ہوتا ہے اور پولیمرائزیشن کو روکتا ہے، جانوروں کے خلیوں کے لیے کم زہریلا ہونے کی وجہ سے اسے جڑی بوٹی مار دوا کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے۔disopyramide کے برعکس، متعلقہ benzamides میں مختلف ہدف کی خصوصیات ہیں۔پودوں کے مائیکرو ٹیوبلز کے علاوہ، RH-4032 یا benzoxamide بالترتیب حیوانی خلیات یا oomycetes کے مائیکرو ٹیوبلز کو بھی روکتا ہے، اور zalilamide اپنی کم فائیٹوٹوکسٹی 25,26,27 کی وجہ سے فنگسائڈ کے طور پر استعمال ہوتا ہے۔نئے دریافت شدہ ریچھ اور اس کے مشتقات پودوں کے خلاف منتخب سائٹوٹوکسٹی کی نمائش کرتے ہیں، لیکن یہ بات قابل غور ہے کہ مزید تبدیلیاں ان کے ہدف کی مخصوصیت کو تبدیل کر سکتی ہیں، ممکنہ طور پر روگجنک فنگس یا اوومیسیٹس کے کنٹرول کے لیے اضافی مشتقات فراہم کرتی ہیں۔
urbenonic acid اور اس کے مشتق کی منفرد خصوصیات جڑی بوٹیوں سے دوچار ہونے اور تحقیقی آلات کے طور پر استعمال کرنے کے لیے مفید ہیں۔پودوں کے خلیوں کی شکل کو کنٹرول کرنے میں سائٹوسکلٹن کی اہمیت کو بڑے پیمانے پر تسلیم کیا جاتا ہے۔ابتدائی مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ پودوں نے مورفوجنیسیس کو مناسب طریقے سے کنٹرول کرنے کے لیے مائکروٹوبول کی حرکیات کو کنٹرول کرکے کارٹیکل مائکروٹوبول تنظیم کے پیچیدہ میکانزم کو تیار کیا ہے۔مائیکرو ٹیوبول کی سرگرمی کے ضابطے کے لیے ذمہ دار مالیکیولز کی ایک بڑی تعداد کی نشاندہی کی گئی ہے، اور متعلقہ تحقیق ابھی 3,4,28 جاری ہے۔پودوں کے خلیوں میں مائکروٹوبول کی حرکیات کے بارے میں ہماری موجودہ تفہیم کارٹیکل مائکروٹوبول تنظیم کے طریقہ کار کی پوری طرح وضاحت نہیں کرتی ہے۔مثال کے طور پر، اگرچہ disopyramide اور oryzalin دونوں مائیکرو ٹیوبولس کو ڈی پولیمرائز کر سکتے ہیں، لیکن ڈسپیرامائیڈ جڑوں کو شدید مسخ کرنے کا سبب بنتا ہے جبکہ اوریزالین کا نسبتاً ہلکا اثر ہوتا ہے۔مزید برآں، ٹیوبلین میں تغیرات، جو مائیکرو ٹیوبلز کو مستحکم کرتے ہیں، جڑوں میں ڈیکسٹروٹیشن کا سبب بھی بنتے ہیں، جب کہ پیلیٹیکسیل، جو مائیکرو ٹیوبول کی حرکیات کو بھی مستحکم کرتا ہے، ایسا نہیں کرتا ہے۔لہذا، ursolic ایسڈ کے سالماتی اہداف کا مطالعہ اور شناخت کرنے سے پودوں کے کارٹیکل مائکروٹوبولس کے ضابطے میں نئی بصیرت فراہم کرنی چاہیے۔اسی طرح، مستقبل میں ایسے کیمیکلز کا موازنہ جو مسخ شدہ نشوونما کو فروغ دینے میں کارگر ہیں، جیسے کہ ڈسپوپرامائڈ، اور کم موثر کیمیکلز، جیسے اوریزالین یا کماموٹرک ایسڈ، اس بات کا سراغ فراہم کریں گے کہ کس طرح مسخ شدہ نمو ہوتی ہے۔
دوسری طرف، دفاع سے متعلق سائٹوسکیلیٹل دوبارہ ترتیب ursonic ایسڈ کی cytotoxicity کی وضاحت کرنے کا ایک اور امکان ہے۔پیتھوجین کا انفیکشن یا پودوں کے خلیوں میں ایلیسٹر کا داخل ہونا بعض اوقات سائٹوسکلٹن کی تباہی اور اس کے نتیجے میں خلیوں کی موت کا سبب بنتا ہے۔مثال کے طور پر، oomycete سے ماخوذ کرپٹوکسینتھین کو تمباکو کے خلیوں کی موت سے پہلے مائیکرو ٹیوبلز اور ایکٹین فلامینٹ میں خلل ڈالنے کی اطلاع دی گئی ہے، جیسا کہ KAND علاج30,31 کے ساتھ ہوتا ہے۔ursonic ایسڈ کی طرف سے حوصلہ افزائی کے دفاعی ردعمل اور سیلولر ردعمل کے درمیان مماثلت ہمیں یہ قیاس کرنے پر مجبور کرتی ہے کہ وہ عام سیلولر عمل کو متحرک کرتے ہیں، حالانکہ کرپٹوکسانتھین کے مقابلے میں ursonic ایسڈ کا تیز اور مضبوط اثر واضح ہے۔تاہم، مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ ایکٹین فلیمینٹس میں خلل اچانک سیل کی موت کو فروغ دیتا ہے، جو ہمیشہ مائکروٹوبول میں خلل کے ساتھ نہیں ہوتا ہے۔اس کے علاوہ، یہ دیکھنا باقی ہے کہ آیا پیتھوجین یا ایلیسٹر جڑوں کی مسخ شدہ نشوونما کا سبب بنتے ہیں، جیسا کہ ursonic ایسڈ ڈیریویٹوز کرتے ہیں۔اس طرح، دفاعی ردعمل اور سائٹوسکلٹن کو جوڑنے والا مالیکیولر علم ایک پرکشش مسئلہ ہے جس پر توجہ دی جائے۔ursonic ایسڈ سے متعلق کم مالیکیولر وزن والے مرکبات کی موجودگی کے ساتھ ساتھ مختلف قوتوں کے ساتھ مشتقات کی ایک رینج کا فائدہ اٹھا کر، وہ نامعلوم سیلولر میکانزم کو نشانہ بنانے کے مواقع فراہم کر سکتے ہیں۔
ایک ساتھ مل کر، نئے مرکبات کی دریافت اور اطلاق جو مائیکرو ٹیوبول ڈائنامکس کو ماڈیول کرتے ہیں پودوں کے خلیے کی شکل کے تعین کے تحت پیچیدہ مالیکیولر میکانزم کو حل کرنے کے لیے طاقتور طریقے فراہم کریں گے۔اس تناظر میں، حال ہی میں تیار کردہ کمپاؤنڈ urmotonic ایسڈ، جو مائیکرو ٹیوبولس اور ایکٹین فلامینٹس کو متاثر کرتا ہے اور سیل کی موت کا باعث بنتا ہے، مائیکرو ٹیوبول کنٹرول اور ان دیگر میکانزم کے درمیان تعلق کو سمجھنے کا موقع فراہم کر سکتا ہے۔اس طرح، urbenonic ایسڈ کا استعمال کرتے ہوئے کیمیائی اور حیاتیاتی تجزیہ ہمیں ان مالیکیولر ریگولیٹری میکانزم کو سمجھنے میں مدد کرے گا جو پودے کے cytoskeleton کو کنٹرول کرتے ہیں۔
S. werraensis MK493-CF1 کو 500 ملی لیٹر کے حیران کن ایرلن میئر فلاسک میں ٹیکہ لگائیں جس میں 110 ملی لیٹر سیڈ میڈیم جس میں 2% (w/v) galactose، 2% (w/v) ایسنس پیسٹ، 1% (w/v) بیکٹو کمپوزیشن شامل ہو۔ .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.)، 0.5% (w/v) مکئی کا عرق (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan)، 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 اور 0.2% CaCO3 deionized پانی میں۔(نس بندی سے پہلے پی ایچ 7.4)۔بیجوں کی ثقافتوں کو روٹری شیکر (180 rpm) پر 27 ° C پر 2 دن کے لیے انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ٹھوس حالت کے ابال کے ذریعے پیداواری کاشت۔سیڈ کلچر (7 ملی لیٹر) کو 500 ملی لیٹر کے K-1 فلاسک میں منتقل کیا گیا جس میں 40 گرام پروڈکشن میڈیم جس میں 15 جی پریسڈ جو (MUSO Co., Limited, Japan) اور 25 g deionized water (pH ایڈجسٹ نہیں کیا گیا) پر مشتمل ہے۔ نس بندی سے پہلے)۔)۔14 دن تک اندھیرے میں 30 ° C پر ابال کیا گیا تھا۔ابال کے مواد کو 40 ملی لیٹر/بوتل EtOH اور سینٹرفیوجڈ (1500 گرام، 4 ° C، 10 منٹ) کے ساتھ نکالا گیا تھا۔کلچر سپرنٹنٹ (60 ملی لیٹر) 10٪ MeOH/EtOAc کے مرکب کے ساتھ نکالا گیا تھا۔اوشیشوں (59.5 ملی گرام) کو حاصل کرنے کے لیے نامیاتی پرت کو کم دباؤ کے تحت بخارات بنایا گیا تھا، جسے HPLC کے ساتھ گراڈینٹ ایلیوشن (0–10 منٹ: 90%) کے ساتھ ریورس فیز کالم (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120، 5 μm، ID) کا نشانہ بنایا گیا تھا۔ 10 ملی میٹر × لمبائی 250 ملی میٹر) H2O/CH3CN، 10–35 منٹ: 90% H2O/CH3CN سے 70% H2O/CH3CN (گریڈینٹ)، 35–45 منٹ: 90% H2O/EtOH، 45–155 منٹ: 90% HO2 /EtOH سے 100% EtOH (گریڈینٹ (گریڈینٹ)، 155–200 منٹ: 100% EtOH) 1.5 ملی لیٹر/منٹ کی بہاؤ کی شرح پر، کومامونامائڈ (1، 36.0 ملی گرام) کو سفید بے ساختہ پاؤڈر کے طور پر الگ تھلگ کیا گیا تھا۔
Kumamotoamide (1)؛1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H)۔, 4.08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ حسابی قدر: 141.0659، پیمائش شدہ قدر: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1593, 1573cm۔
کولمبیا کے بیج (Col-0) Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) سے تحقیقی استعمال کی اجازت کے ساتھ حاصل کیے گئے تھے۔Col-0 کے بیجوں کو ہماری لیبارٹری کے حالات میں پھیلایا اور برقرار رکھا گیا اور جنگلی قسم کے Arabidopsis پودوں کے طور پر استعمال کیا گیا۔عربیڈوپسس کے بیجوں کو سطحی جراثیم سے پاک کیا گیا تھا اور نصف طاقت والے مراشیج اور اسکوگ میڈیم میں کلچر کیا گیا تھا جس میں 2% سوکروز (فوجی فلم واکو پیور کیمیکل)، 0.05% (w/v) 2- (4-morpholino) ایتھین سلفونک ایسڈ (MES) ( Fujifilmical Wako Pure Chemical) )۔) اور 1.5% آگر (فوجی فلم واکو پیور کیمیکل)، پی ایچ 5.7، 23 °C پر اور مسلسل روشنی۔phs1-1 mutant کے بیج T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) نے فراہم کیے تھے۔
تناؤ SR-1 کے بیج ٹی ہاشیموتو (نارا انسٹی ٹیوٹ آف سائنس اینڈ ٹیکنالوجی) نے فراہم کیے تھے اور جنگلی قسم کے تمباکو کے پودوں کے طور پر استعمال کیے گئے تھے۔تمباکو کے بیجوں کو سطح پر جراثیم سے پاک کیا گیا اور انکرن کو فروغ دینے کے لیے تین راتوں تک جراثیم سے پاک پانی میں بھگو دیا گیا، پھر نصف طاقت والے محلول میں رکھا گیا جس میں 2% سوکروز، 0.05% (w/v) MES، اور 0.8% جیلان گم (فوجی فلم واکو پیور کیمیکل) مراشیگےاور اسکوگ میڈیم) پی ایچ 5.7 کے ساتھ اور مسلسل روشنی میں 23°C پر انکیوبیٹڈ۔
Strain Tak-1 کو T. Kohchi (کیوٹو یونیورسٹی) نے فراہم کیا تھا اور اسے جگر کے مطالعہ کے لیے معیاری تجرباتی یونٹ کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔جیما کو جراثیم سے پاک کلچرڈ پودوں سے حاصل کیا گیا اور پھر گیمبورگ بی 5 میڈیم (فوجی فلم واکو پیور کیمیکل) پر چڑھایا گیا جس میں 1% سوکروز اور 0.3% گیلن گم اور مسلسل روشنی میں 23°C پر انکیوبیٹ کیا گیا۔
ٹوبیکو BY-2 سیل (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) S. Hasezawa (یونیورسٹی آف ٹوکیو) نے فراہم کیے تھے۔BY-2 خلیات کو تبدیل شدہ Linsmeier اور Skoog میڈیم میں 95 گنا کم کیا گیا اور ہفتہ وار 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 32 کے ساتھ سپلیمنٹ کیا گیا۔اندھیرے میں 27 ° C پر 130 rpm پر سیل سسپنشن کو روٹری شیکر پر ملایا گیا تھا۔خلیوں کو تازہ میڈیم کے 10 گنا حجم کے ساتھ دھوئیں اور اسی میڈیم میں دوبارہ معطل کریں۔گوبھی موزیک وائرس 35S پروموٹر کے تحت مائکروٹوبول مارکر TagRFP-TUA6 یا ایکٹین فلیمینٹ مارکر GFP-ABD2 کو مستحکم طور پر ظاہر کرنے والی BY-2 ٹرانسجینک سیل لائنیں تیار کی گئیں جیسا کہ بیان کیا گیا ہے 33,34,35۔ان سیل لائنوں کو اصل BY-2 سیل لائن کے لیے استعمال کیے جانے والے طریقہ کار سے ملتے جلتے طریقے سے برقرار اور ہم آہنگ کیا جا سکتا ہے۔
HeLa کے خلیات کو Dulbecco کے ترمیم شدہ Eagle's Medium (DMEM) (Life Technologies) میں 10% fetal bovine serum، 1.2 U/ml penicillin، اور 1.2 μg/ml streptomycin کے ساتھ 37°C CO2 کے ساتھ انکیوبیٹر میں کلچر کیا گیا تھا۔
اس مخطوطہ میں بیان کردہ تمام تجربات جاپانی بائیو سیفٹی کے ضوابط اور رہنما خطوط کے مطابق کیے گئے تھے۔
مرکبات کو ڈائمتھائل سلفوکسائیڈ (DMSO؛ Fujifilm Wako Pure Chemical) میں سٹاک سلوشنز کے طور پر تحلیل کیا گیا اور Arabidopsis کے لیے MS میڈیم اور تمباکو یا Gamborg B5 میڈیم میں جگر کے ورٹ کے لیے حل کیا گیا۔جڑ کی نشوونما کی روک تھام پرکھ کے لیے، فی پلیٹ 10 سے زیادہ بیج آگر میڈیم پر بوئے گئے تھے جن میں اشارے شدہ مرکبات یا DMSO تھے۔بیجوں کو گروتھ چیمبر میں 7 دن تک انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔پودوں کی تصویر کشی کی گئی اور جڑوں کی لمبائی کی پیمائش کی گئی۔Arabidopsis انکرن پرکھ کے لئے، فی پلیٹ 48 بیج آگر میڈیم پر بوئے گئے تھے جس میں 200 μM کمپاؤنڈ یا DMSO تھا۔عربیڈوپسس کے بیج ایک گروتھ چیمبر میں اگائے گئے تھے اور انکرن (ڈاگ) کے 7 دن بعد انکرن شدہ پودوں کی تعداد شمار کی گئی تھی۔تمباکو کے انکرن پرکھ کے لیے، فی پلیٹ 24 بیج آگر میڈیم پر بوئے گئے جس میں 200 μM KAND یا DMSO تھا۔تمباکو کے بیجوں کو گروتھ چیمبر میں اگایا جاتا تھا اور 14 دن کے بعد انکرن والے بیجوں کی گنتی کی جاتی تھی۔لیورورٹ کی نشوونما کو روکنے کے پرکھ کے لئے ، ہر پلیٹ سے 9 ایمبریو کو آگر میڈیم پر چڑھایا گیا تھا جس میں KAND یا DMSO کی نشاندہی کی گئی تھی اور 14 دن کے لئے گروتھ چیمبر میں انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔
جڑوں کے مرسٹیم کی تنظیم کو دیکھنے کے لیے 5 ملی گرام/ملی لیٹر پروپیڈیم آئیوڈائڈ (PI) سے داغے ہوئے بیجوں کا استعمال کریں۔ٹی سی ایس ایس پی ای کنفوکل لیزر اسکیننگ مائیکروسکوپ (لائیکا مائیکرو سسٹم) کا استعمال کرتے ہوئے فلوروسینس مائکروسکوپی کے ذریعہ پی آئی سگنلز کا مشاہدہ کیا گیا۔
β-glucuronidase (GUS) کے ساتھ جڑوں کا ہسٹو کیمیکل داغ ملامی اور بینفی 36 کے بیان کردہ پروٹوکول کے مطابق انجام دیا گیا تھا۔بیجوں کو راتوں رات 90% ایسیٹون میں طے کیا گیا، 0.5 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic ایسڈ سے GUS بفر میں 1 گھنٹے کے لیے داغ دیا گیا اور ہائیڈریٹڈ کلورالڈہائیڈ محلول میں رکھا گیا۔(8 جی کلورل ہائیڈریٹ، 2 ملی لیٹر پانی اور 1 ملی لیٹر گلیسرول) اور ایکسیو امیجر M1 مائکروسکوپ (کارل زیس) کا استعمال کرتے ہوئے تفریق مداخلت کنٹراسٹ مائکروسکوپی کے ذریعے مشاہدہ کیا گیا۔
جڑ کے زاویوں کو عمودی طور پر رکھی ہوئی پلیٹوں پر اگائے گئے 7 دن پرانے پودوں پر ماپا گیا۔گریویٹی ویکٹر کی سمت سے جڑ کے زاویے کی پیمائش کریں جیسا کہ مرحلہ 6 میں بیان کیا گیا ہے۔
پروٹوکول 37 میں معمولی ترمیم کے ساتھ، کارٹیکل مائکروٹوبولس کا انتظام جیسا کہ بیان کیا گیا ہے دیکھا گیا۔اینٹی β-ٹبلن اینٹی باڈی (KMX-1، مرک ملی پور: MAB3408) اور Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) کو 1:1000 اور 1:100 پر پرائمری اور سیکنڈری اینٹی باڈیز کے طور پر استعمال کیا گیا، بالترتیبفلوروسینس امیجز ٹی سی ایس ایس پی ای کنفوکل لیزر اسکیننگ مائکروسکوپ (لائیکا مائیکرو سسٹم) کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کی گئیں۔زیڈ اسٹیک امیجز حاصل کریں اور مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق زیادہ سے زیادہ شدت کے تخمینے بنائیں۔
HeLa سیل پھیلاؤ پرکھ کارخانہ دار کی ہدایات کے مطابق سیل کاؤنٹنگ کٹ 8 (Dojindo) کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا تھا۔
E. coli DH5α کی نشوونما کا تجزیہ 600 nm (OD600) پر سپیکٹرو فوٹومیٹر کا استعمال کرتے ہوئے کلچر میں سیل کی کثافت کی پیمائش کے ذریعے کیا گیا۔
ٹرانسجینک BY-2 خلیوں میں سائٹوسکیلیٹل تنظیم کو فلوروسینس مائکروسکوپ کا استعمال کرتے ہوئے دیکھا گیا جو CSU-X1 کنفوکل اسکیننگ ڈیوائس (یوکوگاوا) اور ایک ایس سی ایم او ایس کیمرہ (زائلا، اینڈور ٹیکنالوجی) سے لیس تھا۔تصویری تجزیہ کے ذریعہ سائٹوسکیلیٹل کثافت کا اندازہ لگایا گیا ، جس نے 38,39 کے مطابق امیج جے سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے کنفوکال امیجز میں سائٹوپلاسمک پکسلز کے درمیان سائٹوسکیلیٹل پکسلز کی فیصد کی مقدار درست کی۔
BY-2 خلیوں میں سیل کی موت کا پتہ لگانے کے لیے، کمرے کے درجہ حرارت پر 10 منٹ کے لیے سیل سسپینشن کا ایک ایلی کوٹ 0.05٪ ایونز بلیو کے ساتھ لگایا گیا تھا۔مردہ خلیوں کا سلیکٹیو ایونز بلیو سٹیننگ برقرار پلازما جھلی 40 کے ذریعے قابل عمل خلیوں سے ڈائی کے اخراج پر منحصر ہے۔داغ والے خلیوں کو روشن فیلڈ مائکروسکوپ (BX53، اولمپس) کا استعمال کرتے ہوئے دیکھا گیا۔
HeLa خلیات DMEM میں 10% FBS کے ساتھ 37°C اور 5% CO2 پر نمی والے انکیوبیٹر میں اگائے گئے تھے۔خلیوں کا علاج 100 μM KAND 11، کمامونومک ایسڈ 6، کمامونامائڈ 1، 100 ng/ml colcemid (Gibco)، یا 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) کے ساتھ 37 ° C پر 6 گھنٹے کے لیے کیا گیا۔خلیوں کو میٹ او ایچ کے ساتھ 10 منٹ اور پھر کمرے کے درجہ حرارت پر 5 منٹ کے لئے ایسیٹیٹ کے ساتھ طے کیا گیا تھا۔فکسڈ سیلز کو β-tubulin پرائمری اینٹی باڈی (1D4A4، Proteintech: 66240-1) کے ساتھ 0.5% BSA/PBS میں 2 گھنٹے تک پتلا کیا گیا، TBST کے ساتھ 3 بار دھویا گیا، اور پھر Alexa Fluor goat antibody کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا۔488 1 گھنٹہ- ماؤس آئی جی جی (تھرمو فشر سائنٹیفک: A11001) اور 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 0.5% BSA/PBS میں پتلا۔ٹی بی ایس ٹی سے تین بار دھونے کے بعد، نیکن ایکلیپس Ti-E الٹی مائکروسکوپ پر داغدار خلیات دیکھے گئے۔MetaMorph سافٹ ویئر (مالیکیولر ڈیوائسز) کا استعمال کرتے ہوئے ٹھنڈے ہوئے Hamamatsu ORCA-R2 CCD کیمرہ سے تصاویر کھینچی گئیں۔
پوسٹ ٹائم: جون-17-2024