MAMP سے حاصل شدہ دفاعی ردعمل کی طاقت اور جوار میں پتوں کے نشان کے خلاف مزاحمت کا جینوم وسیع ایسوسی ایشن تجزیہ

پلانٹ اور پیتھوجین مواد

سورگم ایسوسی ایشن کی نقشہ سازی آبادی جسے سورگم کنورژن پاپولیشن (SCP) کے نام سے جانا جاتا ہے ڈاکٹر پیٹ براؤن نے یونیورسٹی آف الینوائے (اب UC ڈیوس میں) فراہم کیا تھا۔یہ پہلے بیان کیا جا چکا ہے اور امریکی ماحول میں پودوں کی نشوونما اور نشوونما کو آسان بنانے کے لیے فوٹو پیریڈ غیر حساسیت اور چھوٹے قد میں تبدیل ہونے والی متنوع لائنوں کا مجموعہ ہے۔اس تحقیق میں اس آبادی کی 510 لائنیں استعمال کی گئیں حالانکہ خراب انکرن اور کوالٹی کنٹرول کے دیگر مسائل کی وجہ سے تینوں خصلتوں کے تجزیے میں تمام لائنیں استعمال نہیں کی گئیں۔بالآخر 345 لائنوں کا ڈیٹا chitin ردعمل کے تجزیہ کے لیے، flg22 کے جواب کے لیے 472 لائنوں، اور TLS مزاحمت کے لیے 456 لائنوں کا استعمال کیا گیا۔B. کوکیسٹرین ایل ایس ایل پی 18 یونیورسٹی آف آرکنساس میں ڈاکٹر برٹ بلہم سے حاصل کیا گیا تھا۔

MAMP ردعمل کی پیمائش

اس مطالعے میں دو مختلف MAMPs flg22، (Genscript catalog# RP19986)، اور chitin استعمال کیے گئے تھے۔جوار کے پودے گرین ہاؤس میں مٹی سے بھرے فلیٹوں (33% سن شائن ریڈی ارتھ پرو گروونگ مکس) پر رکھے ہوئے داخلوں میں اگائے گئے تھے۔نمونے جمع کرنے سے ایک دن پہلے پودوں کو پانی پلایا جاتا تھا تاکہ جمع کرنے والے دن پتوں کی اضافی نمی سے بچا جا سکے۔

لائنوں کو بے ترتیب کیا گیا تھا اور، لاجسٹک وجوہات کی بناء پر، 60 لائنوں کے بیچوں میں لگائے گئے تھے۔ہر سطر کے لیے، فی سطر میں دو بیجوں کے ساتھ تین 'برتن' لگائے گئے تھے۔اس کے بعد کے بیچوں کو جیسے ہی پچھلے بیچ پر کارروائی کی گئی تھی اس وقت تک لگائے گئے تھے جب تک کہ پوری آبادی کا اندازہ نہیں لگایا گیا تھا۔دونوں MAMPs کے لیے دو تجرباتی رنز کیے گئے جن میں سے ہر دو رنز میں جین ٹائپس کو دوبارہ بے ترتیب بنایا گیا۔

جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے آر او ایس اسیس کیے گئے تھے۔مختصراً، ہر لائن کے لیے چھ بیج 3 مختلف گملوں میں لگائے گئے تھے۔نتیجے کے بیجوں میں سے، یکسانیت کی بنیاد پر تین کا انتخاب کیا گیا۔وہ پودے جو غیر معمولی نظر آتے تھے یا نمایاں طور پر لمبے یا اکثریت سے چھوٹے تھے استعمال نہیں کیے گئے تھے۔تین مختلف 15 دن پرانے جوار کے پودوں کے چوتھے پتے کے چوڑے حصے سے 3 ملی میٹر قطر کی چار لیف ڈسکس نکالی گئیں۔دو پودوں سے ایک ڈسک فی پتی اور ایک پودے سے دو ڈسک، دوسری ڈسک پانی کا کنٹرول بنتی ہے (نیچے دیکھیں)۔ڈسکس کو انفرادی طور پر 50 µl H20 پر سیاہ 96 کنویں کی پلیٹ میں تیرا گیا، روشنی کی نمائش سے بچنے کے لیے ایلومینیم کی مہر سے بند کیا گیا، اور رات بھر کمرے کے درجہ حرارت پر رکھا گیا۔اگلی صبح 2 mg/ml chemiluminescent probe L-012 (Wako، catalog # 120-04891)، 2 mg/ml ہارسریڈش پیرو آکسیڈیس (ٹائپ VI-A، سگما-الڈرچ، کیٹلاگ # P6782) کا استعمال کرتے ہوئے ایک رد عمل کا حل بنایا گیا، اور 100 mg/ml Chitin یا 2 μM Flg22۔اس رد عمل کے حل کا 50 μl چار کنوؤں میں سے تین میں شامل کیا گیا تھا۔چوتھا کنواں ایک فرضی کنٹرول تھا، جس میں MAMP کو چھوڑ کر رد عمل کا حل شامل کیا گیا تھا۔ہر پلیٹ میں صرف پانی والے چار خالی کنویں بھی شامل تھے۔

رد عمل کا حل شامل کرنے کے بعد، luminescence کی پیمائش SynergyTM 2 ملٹی ڈیٹیکشن مائکروپلیٹ ریڈر (BioTek) کا استعمال کرتے ہوئے ہر 2 منٹ میں 1 گھنٹے کے لیے کی گئی۔پلیٹ ریڈر اس 1 گھنٹے کے دوران ہر 2 منٹ پر روشنی کی پیمائش کرتا ہے۔ہر کنویں کی قیمت دینے کے لیے تمام 31 ریڈنگز کا مجموعہ شمار کیا گیا۔ہر جین ٹائپ کے لیے MAMP ردعمل کے لیے تخمینی قدر کا حساب لگایا گیا تھا (تین تجرباتی کنوؤں کی اوسط luminescence قدر — فرضی کنویں کی قدر) - مائنس اوسط خالی کنویں کی قدر۔خالی کنویں کی قدریں مسلسل صفر کے قریب تھیں۔

کے لیف ڈسکسنکوٹیانا بینتھامیاناکوالٹی کنٹرول کے مقاصد کے لیے ہر 96 کنویں پلیٹ میں ایک ہائی ریسپانسیو سورگم لائن (SC0003)، اور ایک کم ریسپانسیو سورگم لائن (PI 6069) کو بھی بطور کنٹرول شامل کیا گیا تھا۔

B. کوکیانوکولم کی تیاری اور ٹیکہ لگانا

B. کوکیانوکولم تیار کیا گیا تھا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے۔مختصراً، جوار کے دانوں کو تین دن تک پانی میں بھگو کر رکھا گیا، کلی کیا گیا، 1L مخروطی فلاسکس میں ڈالا گیا اور 15psi اور 121 °C پر ایک گھنٹہ کے لیے آٹوکلیو کیا گیا۔اس کے بعد اناجوں کو ایک تازہ کلچر سے تقریباً 5 ملی لیٹر میکریٹیڈ مائیسیلیا کے ساتھ ٹیکہ لگایا گیا تھا۔B. کوکیLSLP18 الگ تھلگ کر کے کمرے کے درجہ حرارت پر 2 ہفتوں کے لیے چھوڑ دیا جاتا ہے، ہر 3 دن بعد فلاسکس ہلاتے ہیں۔2 ہفتوں کے بعد، فنگس سے متاثرہ جوار کے دانوں کو ہوا سے خشک کر دیا گیا اور پھر کھیت میں ٹیکہ لگانے تک 4 ° C پر محفوظ کر لیا گیا۔ایک ہی انوکولم کو پورے ٹرائل کے لیے استعمال کیا گیا اور ہر سال تازہ بنایا گیا۔ٹیکہ لگانے کے لیے، 6-10 متاثرہ دانے 4-5 ہفتے پرانے جوار کے پودوں کے بھنور میں ڈالے گئے۔ان فنگس سے پیدا ہونے والے بیضوں نے ایک ہفتے کے اندر جوان جوار کے پودوں میں انفیکشن شروع کر دیا۔

بیج کی تیاری

کھیت میں بونے سے پہلے جوار کے بیج کا علاج فنگسائڈ، کیڑے مار دوا، اور سیفنر مرکب سے کیا گیا جس میں ~ 1% Spirato 480 FS فنگسائڈ، 4% Sebring 480 FS فنگسائڈ، 3% Sorpro 940 ES بیج سیفنر شامل ہیں۔اس کے بعد بیجوں کو 3 دن تک ہوا سے خشک کیا گیا جس سے بیجوں کے گرد اس مکسچر کی ایک پتلی کوٹنگ ہو گئی۔سیفنر نے جڑی بوٹی مار دوہری میگنم کو ابھرنے سے پہلے کے علاج کے طور پر استعمال کرنے کی اجازت دی۔

ٹارگٹ لیف سپاٹ مزاحمت کا اندازہ

ایس سی پی کو 14-15 جون 2017 اور 20 جون، 2018 کو کلیٹن، این سی کے سنٹرل کراپس ریسرچ سٹیشن میں ایک بے ترتیب مکمل بلاک ڈیزائن میں ہر معاملے میں دو تجرباتی نقل کے ساتھ لگایا گیا تھا۔تجربات 1.8 میٹر سنگل قطاروں میں 0.9 میٹر قطار کی چوڑائی کے ساتھ 10 بیج فی پلاٹ استعمال کرتے ہوئے لگائے گئے۔کنارے کے اثرات کو روکنے کے لیے ہر تجربے کے چاروں طرف دو سرحدی قطاریں لگائی گئی تھیں۔یہ تجربات 20 جولائی 2017 اور 20 جولائی 2018 کو لگائے گئے تھے جس وقت جوار کے پودے ترقی کے 3 مرحلے پر تھے۔ درجہ بندی ایک سے نو پیمانے پر کی گئی تھی، جہاں بیماری کی کوئی علامت ظاہر نہ کرنے والے پودوں کو نو اور مکمل طور پر اسکور کیا گیا تھا۔ مردہ پودوں کو ایک کے طور پر اسکور کیا گیا تھا۔2017 میں دو ریٹنگز لی گئیں اور 2018 میں چار ریڈنگ ہر سال ٹیکہ لگانے کے دو ہفتے بعد شروع ہوتی ہیں۔sAUDPC (بیماری کے بڑھنے کے وکر کے تحت معیاری علاقہ) کا حساب لگایا گیا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے۔