شوٹ اپیکل میرسٹیم (SAM) کی ترقی اسٹیم فن تعمیر کے لیے اہم ہے۔ پودوں کے ہارمونزgibberellins(GAs) پودوں کی نشوونما کو مربوط کرنے میں کلیدی کردار ادا کرتے ہیں، لیکن SAM میں ان کے کردار کو بخوبی سمجھا جاتا ہے۔ یہاں، ہم نے ڈی ایل اے پروٹین کی انجینئرنگ کے ذریعے GA سگنلنگ کا ایک ریٹیومیٹرک بائیو سینسر تیار کیا ہے تاکہ GA ٹرانسکرپشن ردعمل میں اس کے ضروری ریگولیٹری فنکشن کو دبایا جا سکے جبکہ GA کی شناخت پر اس کے انحطاط کو محفوظ رکھا جا سکے۔ ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ یہ انحطاط پر مبنی بائیو سینسر ترقی کے دوران GA کی سطح اور سیلولر سینسنگ میں ہونے والی تبدیلیوں کو درست طریقے سے ریکارڈ کرتا ہے۔ ہم نے اس بائیو سینسر کو SAM میں GA سگنلنگ کی سرگرمی کا نقشہ بنانے کے لیے استعمال کیا۔ ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ اعلی GA سگنل بنیادی طور پر اعضاء پرائموڈیا کے درمیان واقع خلیوں میں موجود ہوتے ہیں، جو خلیات کے انٹرنوڈ کے پیش خیمہ ہوتے ہیں۔ فنکشن کے فائدے اور نقصان کے طریقوں کا استعمال کرتے ہوئے، ہم مزید یہ ظاہر کرتے ہیں کہ GA سیل ڈویژن طیارے کی واقفیت کو منظم کرتا ہے، انٹرنوڈس کی کینونیکل سیلولر تنظیم کو قائم کرتا ہے، اس طرح SAM میں انٹرنوڈ تفصیلات کو فروغ دیتا ہے۔
شوٹ اپیکس پر واقع شوٹ اپیکل میریسٹم (SAM) میں خلیہ خلیات کا ایک طاق ہوتا ہے جس کی سرگرمی پودے کی پوری زندگی میں ماڈیولر اور تکراری انداز میں پس منظر کے اعضاء اور اسٹیم نوڈس تیار کرتی ہے۔ ان دہرائی جانے والی اکائیوں میں سے ہر ایک، یا پلانٹ نوڈس، نوڈس پر انٹرنوڈس اور پس منظر کے اعضاء، اور پتی کے محور میں محوری مرسٹیمز شامل ہیں۔ ترقی کے دوران پودوں کے نوڈس کی نشوونما اور تنظیم میں تبدیلی آتی ہے۔ Arabidopsis میں، پودوں کے مرحلے کے دوران اندرونی نمو کو دبا دیا جاتا ہے، اور axillary meristems گلاب کے پتوں کے محور میں غیر فعال رہتے ہیں۔ پھولوں کے مرحلے میں منتقلی کے دوران، SAM انفلورسینس میرسٹیم بن جاتا ہے، جس سے لمبے لمبے انٹرنوڈس اور محوری کلیاں، کولین پتوں کے محور میں شاخیں، اور بعد میں بغیر پتوں کے پھول 2 پیدا ہوتے ہیں۔ اگرچہ ہم نے ان میکانزم کو سمجھنے میں اہم پیش رفت کی ہے جو پتوں، پھولوں اور شاخوں کے آغاز کو کنٹرول کرتے ہیں، لیکن انٹرنوڈس کیسے پیدا ہوتے ہیں اس کے بارے میں نسبتاً کم معلوم ہے۔
GAs کی spatiotemporal distribution کو سمجھنے سے مختلف ٹشوز میں اور مختلف ترقیاتی مراحل میں ان ہارمونز کے افعال کو بہتر طور پر سمجھنے میں مدد ملے گی۔ RGA-GFP فیوژن کے انحطاط کا تصور جو اس کے اپنے پروموٹر کی کارروائی کے تحت ظاہر کیا گیا ہے جڑوں 15,16 میں GA کی کل سطحوں کے ضابطے کے بارے میں اہم معلومات فراہم کرتا ہے۔ تاہم، RGA اظہار ٹشوز17 میں مختلف ہوتا ہے اور GA18 کے ذریعے ریگولیٹ کیا جاتا ہے۔ اس طرح، RGA پروموٹر کے امتیازی اظہار کے نتیجے میں RGA-GFP کے ساتھ مشاہدہ کیا گیا فلوروسینس پیٹرن ہو سکتا ہے اور اس طرح یہ طریقہ مقداری نہیں ہے۔ ابھی حال ہی میں، بائیو ایکٹیو فلوروسین (Fl) کے لیبل والے GA19,20 نے روٹ اینڈوکورٹیکس میں GA کے جمع ہونے اور GA ٹرانسپورٹ کے ذریعے اس کے سیلولر لیول کے ریگولیشن کا انکشاف کیا۔ حال ہی میں، GA FRET سینسر nlsGPS1 نے ظاہر کیا کہ GA کی سطحیں جڑوں، تنتوں، اور گہرے بڑھے ہوئے hypocotyls21 میں خلیے کی لمبائی کے ساتھ تعلق رکھتی ہیں۔ تاہم، جیسا کہ ہم نے دیکھا ہے، GA کا ارتکاز GA سگنلنگ سرگرمی کو کنٹرول کرنے والا واحد پیرامیٹر نہیں ہے، کیونکہ یہ پیچیدہ سینسنگ عمل پر منحصر ہے۔ یہاں، DELLA اور GA سگنلنگ پاتھ ویز کے بارے میں ہماری سمجھ کی بنیاد پر، ہم GA سگنلنگ کے لیے انحطاط پر مبنی ریٹیومیٹرک بائیو سینسر کی ترقی اور خصوصیات کی اطلاع دیتے ہیں۔ اس مقداری بائیو سینسر کو تیار کرنے کے لیے، ہم نے ایک اتپریورتی GA-حساس آر جی اے کا استعمال کیا جو فلوروسینٹ پروٹین سے ملایا گیا تھا اور ہر جگہ ٹشوز میں ظاہر کیا گیا تھا، نیز GA-غیر حساس فلوروسینٹ پروٹین۔ ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ اتپریورتی آر جی اے پروٹین فیوژن اینڈوجینس GA سگنلنگ میں مداخلت نہیں کرتے ہیں جب ہر جگہ اظہار کیا جاتا ہے، اور یہ کہ یہ بایو سینسر GA ان پٹ اور GA سگنل پروسیسنگ دونوں کے نتیجے میں سگنلنگ کی سرگرمی کی مقدار درست کر سکتا ہے جس کے نتیجے میں سینسنگ اپریٹس کے ذریعے اعلی اسپیٹیو ٹیمپورل ریزولوشن ہوتا ہے۔ ہم نے اس بائیو سینسر کا استعمال GA سگنلنگ سرگرمی کی spatiotemporal ڈسٹری بیوشن کا نقشہ بنانے اور اس بات کا اندازہ لگانے کے لیے کیا کہ GA SAM ایپیڈرمس میں سیلولر رویے کو کس طرح منظم کرتا ہے۔ ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ GA اعضاء پرائمورڈیا کے درمیان واقع SAM خلیات کے ڈویژن طیارے کی واقفیت کو منظم کرتا ہے، اس طرح انٹرنوڈ کی کینونیکل سیلولر تنظیم کی وضاحت کرتا ہے۔
آخر میں، ہم نے پوچھا کہ کیا qmRGA بڑھتے ہوئے hypocotyls کا استعمال کرتے ہوئے endogenous GA کی سطح میں تبدیلیوں کی اطلاع دے سکتا ہے۔ ہم نے پہلے دکھایا تھا کہ نائٹریٹ GA کی ترکیب کو بڑھا کر اور اس کے نتیجے میں، DELLA34 انحطاط کو بڑھاتا ہے۔ اسی مناسبت سے، ہم نے مشاہدہ کیا کہ pUBQ10::qmRGA پودوں میں ہائپوکوٹائل کی لمبائی نائٹریٹ کی کمی والے حالات میں اگائی جانے والی پودوں کی نسبت نمایاں طور پر لمبی تھی جو نائٹریٹ کی کثرت کی فراہمی (10 mM NO3−) کے تحت ہوتی ہے (ضمنی شکل 6a)۔ نمو کے ردعمل سے ہم آہنگ، GA سگنل نائٹریٹ کی عدم موجودگی میں اگائے جانے والے بیجوں کی نسبت 10 mM NO3− حالات میں اگائے جانے والے پودوں کے ہائپوکوٹائل میں زیادہ تھے (ضمیمہ تصویر 6b، c)۔ اس طرح، qmRGA GA کے ارتکاز میں endogenous تبدیلیوں کی وجہ سے GA سگنلنگ میں تبدیلیوں کی نگرانی کو بھی قابل بناتا ہے۔
یہ سمجھنے کے لیے کہ آیا qmRGA کے ذریعے پتہ چلنے والی GA سگنلنگ کی سرگرمی GA کے ارتکاز اور GA پرسیپشن پر منحصر ہے، جیسا کہ سینسر ڈیزائن کی بنیاد پر توقع کی جاتی ہے، ہم نے پودوں اور تولیدی بافتوں میں تین GID1 ریسیپٹرز کے اظہار کا تجزیہ کیا۔ بیجوں میں، GID1-GUS رپورٹر لائن نے ظاہر کیا کہ GID1a اور c کوٹیلڈنز (تصویر 3a–c) میں بہت زیادہ اظہار کیا گیا تھا۔ اس کے علاوہ، تینوں رسیپٹرز کا اظہار پتوں، پس منظر کی جڑ پرائمورڈیا، جڑ کے اشارے (جی آئی ڈی 1 بی کی جڑ کی ٹوپی کے علاوہ) اور عروقی نظام (تصویر 3a–c) میں کیا گیا تھا۔ inflorescence SAM میں، ہم نے GUS سگنلز صرف GID1b اور 1c (ضمنی شکل 7a–c) کے لیے پائے۔ صورتحال میں ہائبرڈائزیشن نے اظہار کے ان نمونوں کی تصدیق کی اور مزید یہ ظاہر کیا کہ GID1c کا اظہار SAM میں نچلی سطح پر یکساں طور پر کیا گیا تھا، جب کہ GID1b نے SAM (ضمنی شکل 7d–l) کے دائرے میں زیادہ اظہار ظاہر کیا۔ pGID1b::2xmTQ2-GID1b ترجمہی فیوژن نے GID1b اظہار کی ایک درجہ بندی کی حد کا بھی انکشاف کیا، SAM کے مرکز میں کم یا بغیر اظہار سے لے کر اعضاء کی سرحدوں پر اعلی اظہار تک (ضمیمہ تصویر 7m)۔ اس طرح، GID1 ریسیپٹرز یکساں طور پر ٹشوز کے اندر اور اندر تقسیم نہیں ہوتے ہیں۔ بعد کے تجربات میں، ہم نے یہ بھی دیکھا کہ GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) کی حد سے زیادہ کارکردگی نے ہائپوکوٹیلز میں qmRGA کی حساسیت کو بیرونی GA ایپلیکیشن (تصویر 3d، e) میں بڑھا دیا۔ اس کے برعکس، hypocotyl میں qd17mRGA کے ذریعے ماپا جانے والا فلوروسینس GA3 علاج کے لیے غیر حساس تھا (تصویر 3f، g)۔ دونوں پرکھوں کے لیے، سینسر کے تیز رفتار رویے کا اندازہ لگانے کے لیے GA (100 μM GA3) کی اعلی ارتکاز کے ساتھ بیجوں کا علاج کیا گیا، جہاں GID1 رسیپٹر سے منسلک ہونے کی صلاحیت کو بڑھایا گیا یا کھو دیا گیا۔ ایک ساتھ، یہ نتائج اس بات کی تصدیق کرتے ہیں کہ qmRGA بائیو سینسر ایک GA اور GA سینسر کے طور پر ایک مشترکہ کام کرتا ہے، اور تجویز کرتا ہے کہ GID1 ریسیپٹر کا امتیازی اظہار سینسر کے اخراج کو نمایاں طور پر ماڈیول کر سکتا ہے۔
آج تک، SAM میں GA سگنلز کی تقسیم غیر واضح ہے۔ لہذا، ہم نے GA سگنلنگ سرگرمی کے اعلی ریزولیوشن مقداری نقشوں کا حساب لگانے کے لیے qmRGA-اظہار کرنے والے پلانٹس اور pCLV3::mCherry-NLS سٹیم سیل رپورٹر35 کا استعمال کیا، L1 پرت پر توجہ مرکوز کرتے ہوئے (ایپیڈرمیس؛ تصویر 4a، b، دیکھیں طریقے اور ضمنی کردار دیکھیں) یہاں، pCLV3::mCherry-NLS اظہار نے GA سگنلنگ سرگرمی37 کی spatiotemporal تقسیم کا تجزیہ کرنے کے لیے ایک مقررہ جیومیٹرک حوالہ نقطہ فراہم کیا۔ اگرچہ GA کو پس منظر کے اعضاء کی نشوونما کے لیے ضروری سمجھا جاتا ہے4، ہم نے مشاہدہ کیا کہ P3 مرحلے (تصویر 4a، b) سے شروع ہونے والے پھولوں کے پرائمرڈیئم (P) میں GA سگنل کم تھے، جب کہ نوجوان P1 اور P2 پرائمرڈیئمز میں وسطی علاقے کی طرح ہی معتدل سرگرمی تھی (تصویر 4a، b)۔ اعلی GA سگنلنگ سرگرمی کا پتہ آرگن پریمورڈیم باؤنڈریز پر پایا گیا، P1/P2 سے شروع ہو کر (حد کے اطراف میں) اور P4 پر چوٹی کے ساتھ ساتھ پرائمرڈیا (تصویر 4a، b اور سپلیمنٹری تصویر 8a، b) کے درمیان واقع پردیی علاقے کے تمام خلیوں میں۔ یہ اعلی GA سگنلنگ سرگرمی نہ صرف epidermis میں بلکہ L2 اور اوپری L3 تہوں میں بھی دیکھی گئی تھی (ضمیمہ تصویر 8b)۔ qmRGA کا استعمال کرتے ہوئے SAM میں پائے جانے والے GA سگنلز کے پیٹرن میں بھی وقت کے ساتھ کوئی تبدیلی نہیں ہوئی (ضمیمہ تصویر 8c–f, k)۔ اگرچہ qd17mRGA تعمیر کو منظم طریقے سے T3 پلانٹس کے SAM میں پانچ آزاد لائنوں سے کم کیا گیا تھا جس کی ہم نے تفصیل سے خصوصیت کی تھی، ہم pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP تعمیر کے ساتھ حاصل کردہ فلوروسینس پیٹرن کا تجزیہ کرنے کے قابل تھے (ضمیمہ انجیر، 8g)۔ اس کنٹرول لائن میں، SAM میں فلوروسینس تناسب میں صرف معمولی تبدیلیوں کا پتہ چلا، لیکن SAM سینٹر میں ہم نے TagBFP سے وابستہ VENUS میں واضح اور غیر متوقع کمی دیکھی۔ یہ اس بات کی تصدیق کرتا ہے کہ qmRGA کے ذریعہ مشاہدہ کردہ سگنلنگ پیٹرن mRGA-VENUS کے GA پر منحصر انحطاط کی عکاسی کرتا ہے، لیکن یہ بھی ظاہر کرتا ہے کہ qmRGA meristem سینٹر میں GA سگنلنگ کی سرگرمی کو بڑھاوا دے سکتا ہے۔ خلاصہ طور پر، ہمارے نتائج GA سگنلنگ پیٹرن کو ظاہر کرتے ہیں جو بنیادی طور پر primordia کی تقسیم کو ظاہر کرتا ہے۔ بین پرائمری ریجن (IPR) کی یہ تقسیم ترقی پذیر پریمورڈیم اور مرکزی خطے کے درمیان GA سگنلنگ کی اعلیٰ سرگرمی کے بتدریج قیام کی وجہ سے ہے، جبکہ اسی وقت پرائمرڈیم میں GA سگنلنگ کی سرگرمی کم ہو جاتی ہے (تصویر 4c، d)۔
GID1b اور GID1c ریسیپٹرز کی تقسیم (اوپر ملاحظہ کریں) بتاتی ہے کہ GA ریسیپٹرز کا تفریق اظہار SAM میں GA سگنلنگ سرگرمی کے پیٹرن کو تشکیل دینے میں مدد کرتا ہے۔ ہم نے حیرت کا اظہار کیا کہ آیا GA کی تفریق جمع شامل ہوسکتی ہے۔ اس امکان کی چھان بین کے لیے، ہم نے nlsGPS1 GA FRET سینسر21 استعمال کیا۔ 100 منٹ کے لیے 10 μM GA4+7 کے ساتھ علاج کیے گئے nlsGPS1 کے SAM میں ایکٹیویشن فریکوئنسی میں اضافہ کا پتہ چلا (ضمیمہ تصویر 9a–e)، اس بات کی نشاندہی کرتا ہے کہ nlsGPS1 SAM میں GA کی حراستی میں تبدیلیوں کا جواب دیتا ہے، جیسا کہ یہ جڑوں21 میں ہوتا ہے۔ nlsGPS1 ایکٹیویشن فریکوئنسی کی مقامی تقسیم نے SAM کی بیرونی تہوں میں نسبتاً کم GA کی سطح کا انکشاف کیا، لیکن ظاہر کیا کہ وہ مرکز میں اور SAM کی سرحدوں پر بلند ہیں (تصویر 4e اور ضمنی شکل 9a،c)۔ اس سے پتہ چلتا ہے کہ GA کو بھی SAM میں تقسیم کیا گیا ہے جس کا موازنہ qmRGA کے ذریعہ کیا گیا ہے۔ ایک تکمیلی نقطہ نظر کے طور پر، ہم نے SAM کو فلوروسینٹ GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) یا Fl کے ساتھ منفی کنٹرول کے طور پر بھی برتا۔ Fl سگنل پورے SAM میں تقسیم کیا گیا تھا، بشمول مرکزی علاقہ اور پرائمرڈیم، اگرچہ کم شدت کے ساتھ (تصویر 4j اور ضمنی شکل 10d)۔ اس کے برعکس، تینوں GA-Fl خاص طور پر ابتدائی سرحدوں کے اندر اور باقی آئی پی آر میں مختلف ڈگریوں تک جمع ہوئے، GA7-Fl IPR میں سب سے بڑے ڈومین میں جمع ہوتے ہیں (تصویر 4k اور ضمنی شکل 10a،b)۔ فلوروسینس کی شدت کی مقدار سے پتہ چلتا ہے کہ GA-Fl-treated SAM میں Fl-treated SAM (تصویر 4l اور ضمنی شکل 10c) کے مقابلے میں آئی پی آر سے غیر آئی پی آر کی شدت کا تناسب زیادہ تھا۔ ایک ساتھ، یہ نتائج بتاتے ہیں کہ GA آئی پی آر خلیوں میں زیادہ ارتکاز پر موجود ہے جو اعضاء کی سرحد کے قریب واقع ہیں۔ اس سے پتہ چلتا ہے کہ SAM GA سگنلنگ سرگرمی کا نمونہ GA ریسیپٹرز کے امتیازی اظہار اور اعضاء کی سرحدوں کے قریب IPR خلیوں میں GA کے تفریق جمع دونوں سے ہوتا ہے۔ اس طرح، ہمارے تجزیے سے GA سگنلنگ کا ایک غیر متوقع spatiotemporal پیٹرن سامنے آیا، جس میں SAM کے مرکز اور پرائمرڈیم میں کم سرگرمی اور پردیی خطے میں IPR میں زیادہ سرگرمی ہوتی ہے۔
SAM میں تفریق GA سگنلنگ سرگرمی کے کردار کو سمجھنے کے لیے، ہم نے SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS کی ریئل ٹائم ٹائم لیپس امیجنگ کا استعمال کرتے ہوئے GA سگنلنگ سرگرمی، سیل کی توسیع، اور سیل ڈویژن کے درمیان ارتباط کا تجزیہ کیا۔ گروتھ ریگولیشن میں GA کے کردار کو دیکھتے ہوئے، سیل کی توسیع کے پیرامیٹرز کے ساتھ ایک مثبت ارتباط کی توقع کی گئی تھی۔ لہذا، ہم نے سب سے پہلے GA سگنلنگ سرگرمی کے نقشوں کا موازنہ سیل کی سطح کی شرح نمو کے نقشوں سے کیا (ایک پراکسی کے طور پر سیل کی توسیع کی طاقت کے لیے ایک دیئے گئے سیل کے لیے اور ڈویژن میں بیٹی کے خلیوں کے لیے) اور گروتھ انیسوٹروپی کے نقشوں کے ساتھ، جو سیل کی توسیع کی سمت کو ماپتا ہے (یہاں دیے گئے سیل کے لیے اور ڈویژن میں بیٹی کے خلیوں کے لیے بھی استعمال کیا جاتا ہے)؛ میتھڈ اپ، تصویر 5 دیکھیں۔ SAM سیل کی سطح کی شرح نمو کے ہمارے نقشے پچھلے مشاہدات 38,39 سے مطابقت رکھتے ہیں، سرحد پر کم سے کم شرح نمو اور پھولوں کی نشوونما کی زیادہ سے زیادہ شرح کے ساتھ (تصویر 5a)۔ پرنسپل جزو تجزیہ (PCA) نے ظاہر کیا کہ GA سگنلنگ کی سرگرمی سیل کی سطح کی نمو کی شدت (شکل 5c) کے ساتھ منفی طور پر منسلک تھی۔ ہم نے یہ بھی دکھایا کہ تغیرات کے اہم محور، بشمول GA سگنلنگ ان پٹ اور نمو کی شدت، اعلی CLV3 اظہار کے ذریعہ متعین سمت کے لیے آرتھوگونل تھے، جو بقیہ تجزیوں میں SAM سینٹر سے خلیات کے اخراج کی تصدیق کرتے ہیں۔ اسپیئر مین کے ارتباط کے تجزیے نے پی سی اے کے نتائج (فگر 5 ڈی) کی تصدیق کی، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ آئی پی آر میں اعلیٰ GA سگنلز کے نتیجے میں سیل کی زیادہ توسیع نہیں ہوئی۔ تاہم، ارتباط کے تجزیے سے GA سگنلنگ کی سرگرمی اور گروتھ انیسوٹروپی (شکل 5c، d) کے درمیان ایک معمولی مثبت ارتباط کا انکشاف ہوا ہے، یہ تجویز کرتا ہے کہ آئی پی آر میں اعلیٰ GA سگنلنگ سیل کی نشوونما کی سمت اور ممکنہ طور پر سیل ڈویژن طیارے کی پوزیشن کو متاثر کرتی ہے۔
a, b SAM میں اوسط سطح کی نمو (a) اور گروتھ anisotropy (b) کے حرارتی نقشے سات آزاد پودوں سے زیادہ ہیں (بالترتیب سیل کی توسیع کی طاقت اور سمت کے لئے پراکسی کے طور پر استعمال ہوتے ہیں)۔ c PCA تجزیہ میں درج ذیل متغیرات شامل ہیں: GA سگنل، سطح کی نمو کی شدت، سطح کی نمو انیسوٹروپی، اور CLV3 اظہار۔ PCA جزو 1 بنیادی طور پر سطح کی نمو کی شدت کے ساتھ منفی طور پر منسلک تھا اور GA سگنل کے ساتھ مثبت طور پر منسلک تھا۔ پی سی اے جزو 2 بنیادی طور پر سطح کی نمو انیسوٹروپی کے ساتھ مثبت طور پر منسلک تھا اور سی ایل وی 3 اظہار کے ساتھ منفی طور پر منسلک تھا۔ فیصد ہر جزو کے ذریعہ بیان کردہ تغیر کی نمائندگی کرتا ہے۔ d GA سگنل، سطح کی ترقی کی شدت، اور CZ کو چھوڑ کر ٹشو اسکیل پر سطح کی نمو کی انیسوٹروپی کے درمیان اسپیئر مین کے ارتباط کا تجزیہ۔ دائیں طرف نمبر دو متغیر کے درمیان Spearman rho قدر ہے۔ ستارے ایسے معاملات کی نشاندہی کرتے ہیں جہاں ارتباط/منفی ارتباط انتہائی اہم ہے۔ ای کنفوکل مائکروسکوپی کے ذریعہ Col-0 SAM L1 خلیوں کا 3D تصور۔ 10 گھنٹے پر SAM (لیکن پرائمرڈیم نہیں) میں بننے والی نئی سیل دیواریں ان کے زاویہ کی قدروں کے مطابق رنگین ہوتی ہیں۔ رنگ بار نیچے دائیں کونے میں دکھایا گیا ہے۔ انسیٹ متعلقہ 3D امیج کو 0 h پر دکھاتا ہے۔ اسی طرح کے نتائج کے ساتھ تجربہ دو بار دہرایا گیا۔ f باکس پلاٹ IPR اور نان-IPR Col-0 SAM (n = 10 آزاد پودوں) میں سیل ڈویژن کی شرح ظاہر کرتے ہیں۔ سینٹر لائن میڈین کو ظاہر کرتی ہے، اور باکس کی حدود 25ویں اور 75ویں پرسنٹائل کی نشاندہی کرتی ہیں۔ Whiskers R سافٹ ویئر کے ساتھ مقرر کردہ کم سے کم اور زیادہ سے زیادہ اقدار کی نشاندہی کرتے ہیں۔ P قدریں ویلچ کے دو دم والے ٹی ٹیسٹ کے ساتھ حاصل کی گئیں۔ g, h اسکیمیٹک خاکہ دکھا رہا ہے (g) SAM (سفید نقطے والی لکیر) کے مرکز سے ریڈیل سمت کے حوالے سے نئی سیل وال (مینجینٹا) کے زاویے کی پیمائش کیسے کی جائے (صرف شدید زاویہ کی قدریں، یعنی 0–90°، پر غور کیا جاتا ہے)، اور (h) دائرہ / پس منظر اور شعاعی سمتوں کے اندر۔ i بالترتیب SAM (گہرا نیلا)، IPR (درمیانے نیلے) اور نان-IPR (ہلکا نیلا) میں سیل ڈویژن کے طیارہ کی واقفیت کے فریکوئنسی ہسٹوگرام۔ P قدریں دو دم والے کولموگوروف سمرنوف ٹیسٹ کے ذریعے حاصل کی گئیں۔ اسی طرح کے نتائج کے ساتھ تجربہ دو بار دہرایا گیا۔ j P3 (ہلکا سبز)، P4 (درمیانے سبز) اور P5 (گہرا سبز) کے ارد گرد IPR کے سیل ڈویژن طیارہ واقفیت کے فریکوئنسی ہسٹوگرامس۔ P قدریں دو دم والے کولموگوروف سمرنوف ٹیسٹ کے ذریعے حاصل کی گئیں۔ اسی طرح کے نتائج کے ساتھ تجربہ دو بار دہرایا گیا۔
لہذا، ہم نے اگلی بار پرکھ (تصویر 5e) کے دوران نئی بننے والی سیل دیواروں کی شناخت کرکے GA سگنلنگ اور سیل ڈویژن کی سرگرمی کے درمیان ارتباط کی چھان بین کی۔ اس نقطہ نظر نے ہمیں سیل ڈویژن کی فریکوئنسی اور سمت کی پیمائش کرنے کی اجازت دی۔ حیرت انگیز طور پر، ہم نے پایا کہ آئی پی آر اور بقیہ ایس اے ایم (غیر آئی پی آر، تصویر 5 ایف) میں سیل ڈویژنوں کی فریکوئنسی ایک جیسی تھی، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ آئی پی آر اور نان آئی پی آر سیلز کے درمیان GA سگنلنگ میں فرق سیل ڈویژن کو نمایاں طور پر متاثر نہیں کرتا ہے۔ یہ، اور GA سگنلنگ اور گروتھ انیسوٹروپی کے درمیان مثبت ارتباط نے، ہمیں اس بات پر غور کرنے پر آمادہ کیا کہ آیا GA سگنلنگ کی سرگرمی سیل ڈویژن کے ہوائی جہاز کی واقفیت کو متاثر کر سکتی ہے۔ ہم نے نئی سیل دیوار کی واقفیت کو ایک شدید زاویہ کے طور پر ایک شدید زاویہ کے طور پر جو meristem کے مرکز اور نئی خلیہ کی دیوار کے مرکز کو جوڑتا ہے (تصویر 5e-i) اور خلیات کے ریڈیل محور کی نسبت 90° کے قریب زاویوں پر تقسیم ہونے کے واضح رجحان کا مشاہدہ کیا، جس میں سب سے زیادہ تعدد %20 °8 اور مشاہدہ کیا گیا۔ 80–90° (22.62%) (تصویر 5e،i)، گردشی/قطع سمت (تصویر 5h) میں خلیوں کی تقسیم کے مطابق۔ سیل ڈویژن کے اس رویے میں GA سگنلنگ کی شراکت کو جانچنے کے لیے، ہم نے IPR اور غیر IPR میں سیل ڈویژن کے پیرامیٹرز کا الگ الگ تجزیہ کیا (تصویر 5i)۔ ہم نے مشاہدہ کیا کہ IPR خلیوں میں تقسیم زاویہ کی تقسیم غیر IPR خلیوں میں یا پورے SAM کے خلیوں میں اس سے مختلف ہے، جس میں IPR خلیات پس منظر/سرکلر سیل ڈویژنوں کے زیادہ تناسب کی نمائش کرتے ہیں، یعنی 70–80° اور 80–90° (33.86% اور 30.71%) (proportingly portions) F. اس طرح، ہمارے مشاہدات نے ہائی GA سگنلنگ اور سیل ڈویژن کے طیارہ کی سمت بندی کے درمیان ایک ایسوسی ایشن کا انکشاف کیا، جو کہ GA سگنلنگ کی سرگرمی اور گروتھ انیسوٹروپی (تصویر 5c، d) کے درمیان تعلق کی طرح ہے۔ اس ایسوسی ایشن کے مقامی تحفظ کو مزید قائم کرنے کے لیے، ہم نے P3 سے شروع ہونے والے پریمورڈیم کے ارد گرد آئی پی آر سیلز میں تقسیم طیارہ کی واقفیت کی پیمائش کی، کیونکہ اس خطے میں P4 (تصویر 4) سے شروع ہونے والی سب سے زیادہ GA سگنلنگ سرگرمی کا پتہ چلا تھا۔ P3 اور P4 کے ارد گرد IPR کے تقسیم کے زاویوں میں اعداد و شمار کے لحاظ سے کوئی اہم فرق نہیں دکھایا گیا، حالانکہ P4 (تصویر 5j) کے ارد گرد IPR میں پس منظر کے خلیوں کی تقسیم کی بڑھتی ہوئی تعدد دیکھی گئی۔ تاہم، P5 کے آس پاس کے آئی پی آر خلیوں میں، سیل ڈویژن کے طیارہ کی واقفیت میں فرق اعداد و شمار کے لحاظ سے اہم ہو گیا، ٹرانسورس سیل ڈویژنوں کی فریکوئنسی میں تیزی سے اضافہ (تصویر 5j)۔ ایک ساتھ، یہ نتائج بتاتے ہیں کہ GA سگنلنگ SAM میں سیل ڈویژنوں کی واقفیت کو کنٹرول کر سکتا ہے، جو کہ پچھلی رپورٹس 40,41 سے مطابقت رکھتا ہے کہ اعلی GA سگنلنگ IPR میں سیل ڈویژنوں کی پس منظر کی واقفیت کو آمادہ کر سکتی ہے۔
یہ پیشین گوئی کی گئی ہے کہ آئی پی آر میں خلیات پرائمورڈیا میں شامل نہیں ہوں گے بلکہ انٹرنوڈس 2,42,43 میں شامل ہوں گے۔ آئی پی آر میں سیل ڈویژنوں کی ٹرانسورس واقفیت کے نتیجے میں انٹرنوڈس میں ایپیڈرمل خلیوں کی متوازی طول بلد قطاروں کی مخصوص تنظیم ہوسکتی ہے۔ اوپر بیان کردہ ہمارے مشاہدات بتاتے ہیں کہ GA سگنلنگ ممکنہ طور پر سیل ڈویژن کی سمت کو منظم کرکے اس عمل میں ایک کردار ادا کرتا ہے۔
کئی ڈیلا جینز کے فنکشن میں کمی کے نتیجے میں ایک تشکیلاتی GA ردعمل ہوتا ہے، اور ڈیلا اتپریورتیوں کو اس مفروضے کو جانچنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے44۔ ہم نے پہلے SAM میں پانچ DELLA جینوں کے اظہار کے نمونوں کا تجزیہ کیا۔ GUS لائن 45 کے ٹرانسکرپشن فیوژن نے انکشاف کیا کہ GAI، RGA، RGL1، اور RGL2 (بہت کم حد تک) کا اظہار SAM (ضمنی شکل 11a–d) میں کیا گیا تھا۔ صورتحال میں ہائبرڈائزیشن نے مزید یہ ظاہر کیا کہ GAI mRNA خاص طور پر پرائموڈیا اور ترقی پذیر پھولوں میں جمع ہوتا ہے (ضمنی شکل 11e)۔ RGL1 اور RGL3 mRNA کا پتہ پورے SAM کینوپی اور پرانے پھولوں میں پایا گیا تھا، جبکہ RGL2 mRNA سرحدی علاقے میں زیادہ پایا جاتا تھا (ضمیمہ تصویر 11f – h)۔ pRGL3::RGL3-GFP SAM کی کنفوکل امیجنگ نے سیٹو ہائبرڈائزیشن میں مشاہدہ کیے گئے اظہار کی تصدیق کی اور ظاہر کیا کہ RGL3 پروٹین SAM کے مرکزی حصے میں جمع ہوتا ہے (ضمیمہ تصویر 11i)۔ pRGA::GFP-RGA لائن کا استعمال کرتے ہوئے، ہم نے یہ بھی پایا کہ RGA پروٹین SAM میں جمع ہوتا ہے، لیکن P4 سے شروع ہونے والی سرحد پر اس کی کثرت کم ہو جاتی ہے (ضمنی شکل 11j)۔ خاص طور پر، RGL3 اور RGA کے اظہار کے نمونے IPR میں اعلی GA سگنلنگ سرگرمی کے ساتھ مطابقت رکھتے ہیں، جیسا کہ qmRGA (تصویر 4) سے پتہ چلا ہے۔ مزید یہ کہ یہ اعداد و شمار بتاتے ہیں کہ تمام DELLAs کا اظہار SAM میں ہوتا ہے اور یہ کہ ان کا اظہار اجتماعی طور پر پورے SAM پر پھیلا ہوا ہے۔
اس کے بعد ہم نے جنگلی قسم کے SAM (Ler، کنٹرول) اور gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 ڈیلا کوئنٹپل (عالمی) میوٹینٹس (تصویر 6a، b) میں سیل ڈویژن کے پیرامیٹرز کا تجزیہ کیا۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ ہم نے جنگلی قسم (تصویر 6c) کے مقابلے ڈیلا گلوبل اتپریورتی SAM میں سیل ڈویژن اینگل فریکوئنسی کی تقسیم میں شماریاتی طور پر اہم تبدیلی دیکھی۔ ڈیلا گلوبل اتپریورتی میں یہ تبدیلی 80–90 ° زاویوں (34.71% بمقابلہ 24.55%) کی فریکوئنسی میں اضافے کی وجہ سے تھی اور ایک حد تک، 70–80° زاویہ (23.78% بمقابلہ 20.18%)، یعنی ٹرانسورس ڈیویژن سیل (ٹرانسورس سیل 6ig) کے مطابق۔ ڈیلا گلوبل اتپریورتی (تصویر 6c) میں غیر عبوری تقسیم (0–60°) کی تعدد بھی کم تھی۔ ڈیلا گلوبل اتپریورتی (تصویر 6b) کے SAM میں ٹرانسورس سیل ڈویژنوں کی تعدد میں نمایاں اضافہ ہوا تھا۔ آئی پی آر میں ٹرانسورس سیل ڈویژن کی فریکوئنسی بھی جنگلی قسم (تصویر 6 ڈی) کے مقابلے ڈیلا گلوبل اتپریورتی میں زیادہ تھی۔ آئی پی آر کے علاقے سے باہر، جنگلی قسم میں سیل ڈویژن کے زاویوں کی زیادہ یکساں تقسیم تھی، جب کہ ڈیلا گلوبل اتپریورتی نے آئی پی آر (تصویر 6e) جیسی ٹینجینٹل تقسیم کو ترجیح دی۔ ہم نے ga2 oxidase (ga2ox) کوئنٹپل اتپریورتیوں (ga2ox1-1، ga2ox2-1، ga2ox3-1، ga2ox4-1، اور ga2ox6-2) کے SAM میں سیل ڈویژنوں کی واقفیت کو بھی درست کیا، ایک GA- غیر فعال اتپریورتی پس منظر جس میں GA جمع ہوتا ہے۔ GA کی سطح میں اضافے کے ساتھ مطابقت رکھتے ہوئے، Quintuple ga2ox mutant inflorescence کا SAM Col-0 (ضمنی شکل 12a، b) سے بڑا تھا، اور Col-0 کے مقابلے میں، کوئنٹپل ga2ox SAM نے سیل ڈویژن زاویہ کی ایک واضح طور پر مختلف تقسیم ظاہر کی، °5 سے °5 تک بڑھتے ہوئے فریکوئنسی کے ساتھ ٹینجینٹل ڈویژن کے حق میں (ضمیمہ تصویر 12a–c)۔ اس طرح، ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ GA سگنلنگ اور GA جمع کی تشکیلاتی ایکٹیویشن آئی پی آر اور بقیہ SAM میں لیٹرل سیل ڈویژنوں کو آمادہ کرتی ہے۔
a، b PI-stained Ler (a) اور گلوبل ڈیلا اتپریورتی (b) SAM کی L1 پرت کا 3D تصور کنفوکل مائکروسکوپی کا استعمال کرتے ہوئے۔ 10-h کی مدت میں SAM (لیکن پرائمرڈیم نہیں) میں بننے والی نئی سیل والز کو ان کے زاویہ کی قدروں کے مطابق دکھایا اور رنگین کیا جاتا ہے۔ انسیٹ SAM کو 0 h پر دکھاتا ہے۔ رنگ بار نیچے دائیں کونے میں ظاہر ہوتا ہے۔ (b) میں تیر عالمی ڈیلا اتپریورتی میں منسلک سیل فائلوں کی ایک مثال کی طرف اشارہ کرتا ہے۔ اسی طرح کے نتائج کے ساتھ تجربہ دو بار دہرایا گیا۔ Ler اور عالمی ڈیلا کے درمیان پورے SAM (d)، IPR (e) اور غیر IPR (f) میں سیل ڈویژن طیارہ واقفیت کی فریکوئنسی تقسیم کا ce موازنہ۔ P قدریں دو دم والے کولموگوروف سمرنوف ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کی گئیں۔ f, g Col-0 (i) اور pCUC2::gai-1-VENUS (j) ٹرانسجینک پودوں کی PI-stained SAM کی کنفوکل امیجز کا 3D تصور۔ پینلز (a, b) 10 گھنٹے کے اندر SAM میں بننے والی نئی سیل والز (لیکن پرائمورڈیا نہیں) دکھاتے ہیں۔ اسی طرح کے نتائج کے ساتھ تجربہ دو بار دہرایا گیا۔ h–j Col-0 اور pCUC2::gai-1-VENUS پودوں کے درمیان پورے SAM (h)، IPR (i) اور نان-IPR (j) میں واقع سیل ڈویژن کے طیاروں کی تعدد کی تقسیم کا موازنہ۔ P قدریں دو دم والے کولموگوروف – سمرنوف ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کی گئیں۔
اس کے بعد ہم نے آئی پی آر میں خاص طور پر GA سگنلنگ کو روکنے کے اثر کا تجربہ کیا۔ اس مقصد کے لیے، ہم نے کوٹیلڈن کپ 2 (CUC2) پروموٹر کا استعمال کیا تاکہ وینس (pCUC2::gai-1-VENUS لائن میں) میں ایک غالب منفی gai-1 پروٹین کا اظہار کیا جا سکے۔ جنگلی قسم کے SAM میں، CUC2 پروموٹر SAM میں زیادہ تر IPRs کے اظہار کو چلاتا ہے، بشمول بارڈر سیل، P4 کے بعد، اور اسی طرح کا مخصوص اظہار pCUC2::gai-1-VENUS پودوں میں دیکھا گیا (نیچے دیکھیں)۔ pCUC2::gai-1-VENUS پودوں کے SAM یا IPR میں سیل ڈویژن کے زاویوں کی تقسیم جنگلی قسم سے خاصی مختلف نہیں تھی، حالانکہ غیر متوقع طور پر ہم نے پایا کہ ان پودوں میں IPR کے بغیر خلیات 80–90° (تصویر 6f–j) کی اعلی تعدد پر تقسیم ہوئے ہیں۔
یہ تجویز کیا گیا ہے کہ سیل ڈویژن کی سمت کا انحصار SAM کی جیومیٹری پر ہوتا ہے، خاص طور پر ٹشو گھماؤ سے پیدا ہونے والے تناؤ کا تناؤ۔ لہذا ہم نے پوچھا کہ کیا ڈیلا گلوبل اتپریورتی اور pCUC2::gai-1-VENUS پودوں میں SAM کی شکل تبدیل کی گئی ہے۔ جیسا کہ پہلے بتایا گیا ہے 12، ڈیلا گلوبل اتپریورتی SAM کا سائز جنگلی قسم سے بڑا تھا (ضمنی شکل 13a، b، d)۔ سی ایل وی 3 اور ایس ٹی ایم آر این اے کی حالت میں ہائبرڈائزیشن نے ڈیلا اتپریورتیوں میں میرسٹیم کی توسیع کی تصدیق کی اور مزید اسٹیم سیل کے طاق کی پس منظر کی توسیع کو ظاہر کیا (ضمنی شکل 13e, f, h, i)۔ تاہم، SAM گھماؤ دونوں جین ٹائپس میں یکساں تھا (ضمنی شکل 13k, m, n, p)۔ ہم نے جنگلی قسم کے مقابلے میں گھماؤ میں تبدیلی کے بغیر gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 ڈیلا چوگنی اتپریورتی میں سائز میں اسی طرح کے اضافے کا مشاہدہ کیا (ضمنی شکل 13c, d, g, j, l, o, p)۔ سیل ڈویژن واقفیت کی تعدد ڈیلا کواڈرپل اتپریورتی میں بھی متاثر ہوئی تھی، لیکن ڈیلا یک سنگی اتپریورتی (ضمیمہ تصویر 12d–f) کے مقابلے میں کم حد تک۔ یہ خوراک کا اثر، گھماؤ پر اثر کی کمی کے ساتھ، یہ بتاتا ہے کہ ڈیلا چوگنی اتپریورتی میں بقایا RGL3 سرگرمی DELLA سرگرمی کے نقصان کی وجہ سے سیل ڈویژن کی سمت میں تبدیلیوں کو محدود کرتی ہے اور یہ کہ لیٹرل سیل ڈویژنز میں تبدیلی GA سگنلنگ سرگرمی میں تبدیلیوں کے جواب میں ہوتی ہے بجائے SAM جیومیٹری میں تبدیلیاں۔ جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے، CUC2 پروموٹر P4 (ضمنی شکل 14a، b) سے شروع ہونے والے SAM میں IPR اظہار چلاتا ہے، اور اس کے برعکس، pCUC2::gai-1-VENUS SAM کا سائز کم تھا لیکن زیادہ گھما ہوا تھا (ضمنی شکل 14c–h)۔ pCUC2::gai-1-VENUS SAM مورفولوجی میں اس تبدیلی کے نتیجے میں جنگلی قسم کے مقابلے میں مکینیکل تناؤ کی مختلف تقسیم ہو سکتی ہے، جس میں SAM سینٹر47 سے کم فاصلے پر اعلی محیطی دباؤ شروع ہوتے ہیں۔ متبادل طور پر، pCUC2::gai-1-VENUS SAM مورفولوجی میں تبدیلیوں کا نتیجہ علاقائی مکینیکل خصوصیات میں تبدیلیوں کے نتیجے میں ہو سکتا ہے جو ٹرانسجن ایکسپریشن48 کی وجہ سے ہے۔ دونوں ہی صورتوں میں، یہ جزوی طور پر GA سگنلنگ میں ہونے والی تبدیلیوں کے اثرات کو ختم کر سکتا ہے، اس امکان کو بڑھا کر کہ خلیات گردشی/قطری واقفیت میں تقسیم ہو جائیں گے، ہمارے مشاہدات کی وضاحت کرتے ہوئے۔
ایک ساتھ لے کر، ہمارے اعداد و شمار اس بات کی تصدیق کرتے ہیں کہ اعلی GA سگنلنگ آئی پی آر میں سیل ڈویژن طیارے کے پس منظر کی واقفیت میں ایک فعال کردار ادا کرتا ہے۔ وہ یہ بھی ظاہر کرتے ہیں کہ میرسٹیم گھماؤ بھی آئی پی آر میں سیل ڈویژن طیارے کی واقفیت کو متاثر کرتا ہے۔
اعلی GA سگنلنگ سرگرمی کی وجہ سے، آئی پی آر میں ڈویژن کے طیارہ کا ٹرانسورس اورینٹیشن تجویز کرتا ہے کہ GA سیلولر تنظیم کی وضاحت کرنے کے لیے SAM کے اندر ایپیڈرمس میں ایک ریڈیل سیل فائل کو پہلے سے منظم کرتا ہے جو بعد میں ایپیڈرمل انٹرنوڈ میں پائے گی۔ درحقیقت، ایسی سیل فائلیں ڈیلا گلوبل اتپریورتیوں (تصویر 6b) کی SAM تصاویر میں کثرت سے دکھائی دیتی تھیں۔ اس طرح، SAM میں GA سگنلنگ کے مقامی پیٹرن کے ترقیاتی کام کو مزید دریافت کرنے کے لیے، ہم نے IPR میں جنگلی قسم (Ler اور Col-0)، ڈیلا گلوبل میوٹینٹس، اور pCUC2::gai-1-VENUS ٹرانسجینک پلانٹ میں خلیات کی مقامی تنظیم کا تجزیہ کرنے کے لیے ٹائم لیپس امیجنگ کا استعمال کیا۔
ہم نے پایا کہ qmRGA نے ظاہر کیا کہ IPR میں GA سگنلنگ کی سرگرمی P1/P2 سے بڑھی اور P4 پر پہنچ گئی، اور یہ نمونہ وقت کے ساتھ ساتھ مستقل رہا (تصویر 4a–f اور ضمنی شکل 8c–f، k)۔ بڑھتے ہوئے GA سگنل کے ساتھ IPR میں خلیات کی مقامی تنظیم کا تجزیہ کرنے کے لیے، ہم نے P4 کے اوپر اور اطراف میں Ler IPR خلیات کو پہلے مشاہدے کے 34 گھنٹے بعد، یعنی دو سے زیادہ پلاسٹڈ اوقات کے تجزیہ کے مطابق P4 کے اوپر اور اطراف میں لیبل لگایا، جس سے ہمیں P1/P2 سے P4 تک پرائمری ڈیولپمنٹ کے دوران IPR سیلز کی پیروی کرنے کی اجازت ملتی ہے۔ ہم نے تین مختلف رنگوں کا استعمال کیا: ان خلیات کے لیے پیلا جو P4 کے قریب پرائمرڈیم میں ضم ہو گئے تھے، سبز ان کے لیے جو IPR میں تھے، اور جامنی ان لوگوں کے لیے جنہوں نے دونوں عملوں میں حصہ لیا تھا (تصویر 7a–c)۔ T0 (0 h) پر، P4 (تصویر 7a) کے سامنے آئی پی آر سیلز کی 1–2 پرتیں نظر آ رہی تھیں۔ جیسا کہ توقع کی گئی تھی، جب یہ خلیات تقسیم ہوئے، تو انہوں نے ایسا بنیادی طور پر ٹرانسورس ڈویژن جہاز (تصویر 7a–c) کے ذریعے کیا۔ اسی طرح کے نتائج Col-0 SAM (P3 پر توجہ مرکوز کرتے ہوئے، جس کی سرحد Ler میں P4 کی طرح فولڈ ہوتی ہے) کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کیے گئے، حالانکہ اس جینوٹائپ میں پھولوں کی سرحد پر بننے والے فولڈ نے آئی پی آر کے خلیات کو زیادہ تیزی سے چھپایا (تصویر 7g–i)۔ اس طرح، آئی پی آر خلیوں کی تقسیم کا نمونہ خلیات کو پہلے سے ریڈیل قطاروں میں ترتیب دیتا ہے، جیسا کہ انٹرنوڈس میں ہوتا ہے۔ شعاعی قطاروں کی تنظیم اور یکے بعد دیگرے اعضاء کے درمیان آئی پی آر خلیوں کی لوکلائزیشن بتاتی ہے کہ یہ خلیے انٹرنوڈل پروجینٹرز ہیں۔
یہاں، ہم نے ایک تناسب میٹرک GA سگنلنگ بائیو سینسر، qmRGA تیار کیا، جو GA سگنلنگ سرگرمی کی مقداری نقشہ سازی کی اجازت دیتا ہے جس کے نتیجے میں مشترکہ GA اور GA ریسیپٹر ارتکاز کے نتیجے میں اینڈوجینس سگنلنگ پاتھ ویز میں مداخلت کو کم سے کم کیا جاتا ہے، اس طرح سیلولر سطح پر GA فنکشن کے بارے میں معلومات فراہم کرتا ہے۔ اس مقصد کے لیے، ہم نے ایک ترمیم شدہ DELLA پروٹین، mRGA بنایا، جس نے DELLA کے تعامل کے شراکت داروں کو باندھنے کی صلاحیت کھو دی ہے لیکن GA کی حوصلہ افزائی پروٹولیسس کے لیے حساس ہے۔ qmRGA GA کی سطحوں میں خارجی اور endogenous دونوں تبدیلیوں کا جواب دیتا ہے، اور اس کی متحرک سینسنگ خصوصیات ترقی کے دوران GA سگنلنگ سرگرمی میں spatiotemporal تبدیلیوں کا اندازہ لگانے کے قابل بناتی ہیں۔ qmRGA ایک بہت لچکدار ٹول بھی ہے کیونکہ اسے اپنے اظہار کے لیے استعمال کیے جانے والے پروموٹر کو تبدیل کر کے مختلف ٹشوز کے ساتھ ڈھال لیا جا سکتا ہے (اگر ضروری ہو)، اور GA سگنلنگ پاتھ وے کی محفوظ نوعیت اور انجیو اسپرمز میں PFYRE شکل کو دیکھتے ہوئے، اس کے دیگر پرجاتیوں میں منتقلی کے قابل ہونے کا امکان ہے۔ اس کے ساتھ مطابقت رکھتے ہوئے، چاول کے SLR1 DELLA پروٹین (HYY497AAA) میں ایک مساوی تغیر بھی SLR1 کی گروتھ ریپریسر سرگرمی کو دبانے کے لیے دکھایا گیا ہے جبکہ اس کے GA-ثالثی انحطاط کو تھوڑا سا کم کرتا ہے، جیسا کہ mRGA23۔ خاص طور پر، Arabidopsis میں حالیہ مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ PFYRE ڈومین (S474L) میں ایک واحد امینو ایسڈ اتپریورتن نے ٹرانسکرپشن فیکٹر پارٹنرز50 کے ساتھ بات چیت کرنے کی صلاحیت کو متاثر کیے بغیر RGA کی نقل کی سرگرمی کو تبدیل کر دیا۔ اگرچہ یہ اتپریورتن ایم آر جی اے میں موجود 3 امینو ایسڈ کے متبادل کے بہت قریب ہے، لیکن ہمارے مطالعے سے پتہ چلتا ہے کہ یہ دونوں تغیرات DELLA کی الگ الگ خصوصیات کو تبدیل کرتے ہیں۔ اگرچہ زیادہ تر ٹرانسکرپشن فیکٹر پارٹنرز DELLA26,51 کے LHR1 اور SAW ڈومینز سے منسلک ہوتے ہیں، PFYRE ڈومین میں کچھ محفوظ امینو ایسڈ ان تعاملات کو مستحکم کرنے میں مدد کر سکتے ہیں۔
انٹرنوڈ ڈیولپمنٹ پلانٹ کے فن تعمیر اور پیداوار میں بہتری کی ایک اہم خصوصیت ہے۔ qmRGA نے IPR انٹرنوڈ پروجینیٹر سیلز میں اعلی GA سگنلنگ سرگرمی کا انکشاف کیا۔ مقداری امیجنگ اور جینیٹکس کو ملا کر، ہم نے دکھایا کہ GA سگنلنگ پیٹرن SAM ایپیڈرمیس میں سرکلر/ٹرانسورس سیل ڈویژن کے طیاروں کو سپرمپوز کرتے ہیں، جو انٹرنوڈ ڈیولپمنٹ کے لیے درکار سیل ڈویژن تنظیم کو تشکیل دیتے ہیں۔ ڈیولپمنٹ کے دوران سیل ڈویژن طیارہ واقفیت کے متعدد ریگولیٹرز کی نشاندہی کی گئی ہے52,53۔ ہمارا کام ایک واضح مثال فراہم کرتا ہے کہ کس طرح GA سگنلنگ سرگرمی اس سیلولر پیرامیٹر کو منظم کرتی ہے۔ DELLA پہلے سے فولڈنگ پروٹین کمپلیکس 41 کے ساتھ تعامل کر سکتا ہے، لہذا GA سگنلنگ کارٹیکل مائیکرو ٹیوبول اورینٹیشن40,41,54,55 کو براہ راست متاثر کر کے سیل ڈویژن کے طیارہ کی سمت بندی کو منظم کر سکتا ہے۔ ہم نے غیر متوقع طور پر ظاہر کیا کہ SAM میں، اعلی GA سگنلنگ سرگرمی کا ارتباط سیل کی لمبائی یا تقسیم نہیں تھا، بلکہ صرف نمو انیسوٹروپی تھی، جو آئی پی آر میں سیل ڈویژن کی سمت پر GA کے براہ راست اثر کے مطابق ہے۔ تاہم، ہم اس بات کو خارج نہیں کر سکتے کہ یہ اثر بالواسطہ بھی ہو سکتا ہے، مثال کے طور پر GA-حوصلہ افزائی سیل وال نرمی 56 کے ذریعے ثالثی۔ خلیے کی دیوار کی خصوصیات میں تبدیلیاں مکینیکل تناؤ 57,58 پیدا کرتی ہیں، جو کارٹیکل مائیکرو ٹیوبلز39,46,59 کی واقفیت کو متاثر کر کے سیل ڈویژن طیارے کی واقفیت کو بھی متاثر کر سکتی ہے۔ GA-حوصلہ افزائی مکینیکل تناؤ کے مشترکہ اثرات اور GA کی طرف سے مائیکرو ٹیوبول واقفیت کے براہ راست ریگولیشن IPR میں انٹرنوڈس کی وضاحت کے لیے سیل ڈویژن واقفیت کا ایک مخصوص نمونہ پیدا کرنے میں شامل ہو سکتے ہیں، اور اس خیال کو جانچنے کے لیے مزید مطالعات کی ضرورت ہے۔ اسی طرح، پچھلے مطالعات نے انٹرنوڈ فارمیشن 60,61 کے کنٹرول میں DELLA- انٹرایکٹنگ پروٹین TCP14 اور 15 کی اہمیت کو اجاگر کیا ہے اور یہ عوامل BREVIPEDICELLUS (BP) اور PENNYWISE (PNY) کے ساتھ مل کر GA کی کارروائی میں ثالثی کر سکتے ہیں، جو انٹرنوڈ کی نشوونما کو منظم کرتے ہیں اور GA2 GA2 کو متاثر کرتے ہوئے دکھایا گیا ہے۔ یہ دیکھتے ہوئے کہ DELLAs brassinosteroid, ethylene, jasmonic acid, and abscisic acid (ABA) سگنلنگ پاتھ ویز 63,64 کے ساتھ تعامل کرتے ہیں اور یہ کہ یہ ہارمونز مائیکرو ٹیوبول اورینٹیشن65 کو متاثر کر سکتے ہیں، سیل ڈویژن پر GA کے اثرات دوسرے ہارمونز کے ذریعے بھی ثالثی کر سکتے ہیں۔
ابتدائی سائٹولوجیکل مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ عربیڈوپسس ایس اے ایم کے اندرونی اور بیرونی دونوں علاقے انٹرنوڈ ڈویلپمنٹ 2,42 کے لئے ضروری ہیں۔ حقیقت یہ ہے کہ GA اندرونی بافتوں میں سیل ڈویژن کو فعال طور پر منظم کرتا ہے 12 SAM میں میریسٹیم اور انٹرنوڈ سائز کو ریگولیٹ کرنے میں GA کے دوہری فنکشن کی حمایت کرتا ہے۔ دشاتمک سیل ڈویژن کا پیٹرن اندرونی SAM ٹشو میں بھی سختی سے ریگولیٹ کیا جاتا ہے، اور یہ ضابطہ تنوں کی نشوونما کے لیے ضروری ہے۔ یہ جانچنا دلچسپ ہوگا کہ آیا GA اندرونی SAM تنظیم میں سیل ڈویژن کے طیارہ کی سمت بندی کرنے میں بھی کوئی کردار ادا کرتا ہے، اس طرح SAM کے اندر انٹرنوڈس کی تفصیلات اور نشوونما کو ہم آہنگ کرتا ہے۔
پودے مٹی میں وٹرو میں اگائے گئے تھے یا 1x مراشیج-سکوگ (MS) میڈیم (Duchefa) کو 1% sucrose اور 1% agar (Sigma) کے ساتھ معیاری حالات (16 h روشنی، 22 ° C) کے ساتھ ضمیمہ کیا گیا تھا، سوائے ہائپوکوٹائل اور جڑوں کی نشوونما کے تجربات کے جن میں پودوں کو ہلکے 2 ڈگری سینٹی گریڈ پر اگایا گیا تھا۔ نائٹریٹ کے تجربات کے لیے، پودوں کو تبدیل شدہ MS میڈیم (بائیو ورلڈ پلانٹ میڈیم) پر اُگایا گیا جس میں مناسب نائٹریٹ (0 یا 10 mM KNO3)، 0.5 mM NH4-succinate، 1% sucrose اور 1% A-agar (Sigma) طویل دن کے حالات میں شامل تھے۔
pDONR221 میں داخل کردہ GID1a cDNA کو pDONR P4-P1R-pUBQ10 اور pDONR P2R-P3-mCherry کے ساتھ pB7m34GW میں دوبارہ ملایا گیا تاکہ pUBQ10::GID1a-mCherry تیار کیا جا سکے۔ pDONR221 میں داخل کردہ IDD2 DNA کو p35S:IDD2-RFP بنانے کے لیے pB7RWG266 میں دوبارہ ملایا گیا۔ pGID1b::2xmTQ2-GID1b بنانے کے لیے، GID1b کوڈنگ ریجن کا 3.9 kb ٹکڑا اپ اسٹریم اور GID1b cDNA (1.3 kb) اور ٹرمینیٹر (3.4 kb) پر مشتمل ایک 4.7 kb فریگمنٹ کو پہلے پرائمر کا استعمال کرتے ہوئے بڑھایا گیا تھا اور اس کے بعد PRON میں Supple میں پرائمر داخل کیا گیا تھا۔ P4-P1R (تھرمو فشر سائنٹیفک) اور pDONR P2R-P3 (تھرمو فشر سائنٹیفک) بالترتیب، اور آخر میں گیٹ وے کلوننگ کا استعمال کرتے ہوئے pDONR221 2xmTQ268 کے ساتھ pGreen 012567 ٹارگٹ ویکٹر میں دوبارہ ملایا گیا۔ pCUC2::LSSmOrange پیدا کرنے کے لیے، CUC2 پروموٹر ترتیب (ATG کا 3229 bp upstream) جس کے بعد N7 نیوکلیئر لوکلائزیشن سگنل کے ساتھ بڑے Stokes-shifted mOrange (LSSmOrange) 69 کی کوڈنگ ترتیب اور NOS ٹرانسکرپشنل ٹرمنیٹر کا استعمال کرتے ہوئے ٹارگٹ وے کو جمع کیا گیا۔ 3-ٹکڑوں کی بحالی کا نظام (انویٹروجن)۔ پلانٹ کے بائنری ویکٹر کو Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 میں متعارف کرایا گیا اور Agrobacterium infiltration طریقہ سے Nicotiana benthamiana پتوں میں اور Arabidopsis thaliana Col-0 میں بالترتیب فلورل ڈپ طریقہ سے متعارف کرایا گیا۔ pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry اور pCLV3::mCherry-NLS qmRGA کو بالترتیب متعلقہ کراس کی F3 اور F1 اولاد سے الگ تھلگ کر دیا گیا تھا۔
سیٹو ہائبرڈائزیشن میں RNA تقریباً 1 سینٹی میٹر لمبے شوٹ ٹپس72 پر انجام دیا گیا تھا، جنہیں جمع کیا گیا تھا اور فوری طور پر FAA محلول (3.7% formaldehyde، 5% acetic acid، 50% ethanol) کو 4 °C پر پہلے سے ٹھنڈا کر دیا گیا تھا۔ 2 × 15 منٹ ویکیوم ٹریٹمنٹ کے بعد، فکسٹیو کو تبدیل کر دیا گیا اور نمونے راتوں رات لگائے گئے۔ GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, اور RGL3 cDNAs اور ان کے 3′-UTRs کے اینٹی سینس پروبس کو سپلیمنٹری ٹیبل 3 میں دکھائے گئے پرائمر کا استعمال کرتے ہوئے ترکیب کیا گیا جیسا کہ Rosier et al.73 نے بیان کیا ہے۔ ڈیگوکسیجنن کے لیبل والے پروبس کو ڈیگوکسیجنن اینٹی باڈیز (3000 گنا کم کرنے؛ روشے، کیٹلاگ نمبر: 11 093 274 910) کا استعمال کرتے ہوئے امیونوڈیٹیکٹ کیا گیا تھا، اور حصوں کو 5-bromo-4-chloro-3-indolyl فاسفیٹ، BC205/500pblion-5-bromo-4-chloro-3-indolyl فاسفیٹ سے داغ دیا گیا تھا۔ ٹیٹرازولیم (این بی ٹی، 200 گنا کم کرنا) حل۔
پوسٹ ٹائم: فروری 10-2025