پودوں کی نشوونما کے ریگولیٹرز اور آئرن آکسائیڈ نینو پارٹیکلز کے وٹرو آرگنوجنیسس پر ہم آہنگی کے اثرات اور سینٹ جان کے ورٹ میں بائیو ایکٹیو مرکبات کی پیداوار

اس مطالعہ میں، کے مشترکہ علاج کے stimulatory اثراتپلانٹ کی ترقی کے ریگولیٹرز(2,4-D اور kinetin) اور آئرن آکسائیڈ نینو پارٹیکلز (Fe₃O₄-NPs) پر ان وٹرو مورفوجینیسیس اور *Hypericum perforatum* L. میں ثانوی میٹابولائٹ کی پیداوار کی چھان بین کی گئی۔ بہتر طریقہ علاج [2,4-D (0.5 mg/L) + kinetin (2 mg/L) + Fe₃O₄-NPs (4 mg/L)] نے پودوں کی نشوونما کے پیرامیٹرز کو نمایاں طور پر بہتر کیا: پودے کی اونچائی میں 59.6% اضافہ، جڑ کی لمبائی میں 114.0%، بڈ کی تعداد میں 180% اضافہ، تازہ وزن کے مقابلے میں %180 اور %390 کا وزن۔ گروپ اس مشترکہ علاج نے تخلیق نو کی کارکردگی (50.85%) میں بھی اضافہ کیا اور ہائپریسین مواد میں 66.6% اضافہ کیا۔ GC-MS کے تجزیے سے ہائپروسائیڈ، β-patholene، اور cetyl الکحل کے اعلیٰ مواد کا انکشاف ہوا، جو کہ کل چوٹی کے رقبے کا 93.36% ہے، جبکہ کل phenolics اور flavonoids کے مواد میں 80.1% تک اضافہ ہوا۔ یہ نتائج بتاتے ہیں کہ پودوں کی نشوونما کے ریگولیٹرز (PGRs) اور Fe₃O₄ نینو پارٹیکلز (Fe₃O₄-NPs) آرگنوجنیسیس کو متحرک کر کے اور بائیو ایکٹیو مرکبات کو جمع کر کے ہم آہنگی کا اثر ڈالتے ہیں، جو دواؤں کے پودوں کی بائیو ٹیکنالوجی کی بہتری کے لیے ایک امید افزا حکمت عملی کی نمائندگی کرتا ہے۔
سینٹ جان کی ورٹ (Hypericum perforatum L.)، جسے سینٹ جان کی ورٹ بھی کہا جاتا ہے، Hypericaceae خاندان کا ایک بارہماسی جڑی بوٹیوں والا پودا ہے جس کی اقتصادی قدر ہوتی ہے۔[1] اس کے ممکنہ حیاتیاتی اجزاء میں قدرتی ٹیننز، زینتھونز، فلوروگلوسینول، نیفتھلینڈینتھرون (ہائپرین اور سیوڈو ہائپرین)، فلیوونائڈز، فینولک ایسڈز، اور ضروری تیل شامل ہیں۔ تاہم، روایتی طریقوں کی موسمی، کم بیج کا انکرن، اور بیماریوں کے لیے حساسیت اس کی بڑے پیمانے پر کاشت اور ثانوی میٹابولائٹس کی مسلسل تشکیل کی صلاحیت کو محدود کرتی ہے۔[1,5,6]
اس طرح، ان وٹرو ٹشو کلچر کو پودوں کی تیزی سے پھیلاؤ، جراثیم کے وسائل کے تحفظ، اور دواؤں کے مرکبات کی پیداوار میں اضافہ کے لیے ایک مؤثر طریقہ سمجھا جاتا ہے [7، 8]۔ پلانٹ گروتھ ریگولیٹرز (PGRs) مورفوجینیسیس کو منظم کرنے میں ایک اہم کردار ادا کرتے ہیں اور کالس اور پورے جانداروں کی وٹرو کاشت کے لیے ضروری ہیں۔ ان ترقیاتی عملوں کی کامیاب تکمیل کے لیے ان کے ارتکاز اور امتزاج کی اصلاح بہت ضروری ہے [9]۔ لہذا، ریگولیٹرز کی مناسب ساخت اور ارتکاز کو سمجھنا سینٹ جان کے ورٹ (H. perforatum) کی نشوونما اور تخلیقی صلاحیت کو بہتر بنانے کے لیے اہم ہے [10]۔
آئرن آکسائیڈ نینو پارٹیکلز (Fe₃O₄) نینو پارٹیکلز کا ایک طبقہ ہے جو ٹشو کلچر کے لیے تیار کیا گیا ہے یا کیا جا رہا ہے۔ Fe₃O₄ میں نمایاں مقناطیسی خصوصیات، اچھی حیاتیاتی مطابقت، اور پودوں کی نشوونما کو فروغ دینے اور ماحولیاتی دباؤ کو کم کرنے کی صلاحیت ہے، اس لیے اس نے ٹشو کلچر کے ڈیزائن میں کافی توجہ مبذول کرائی ہے۔ ان نینو پارٹیکلز کے ممکنہ استعمال میں سیل ڈویژن کو فروغ دینے، غذائی اجزاء کی مقدار کو بہتر بنانے، اور اینٹی آکسیڈینٹ انزائمز کو چالو کرنے کے لیے وٹرو کلچر کو بہتر بنانا شامل ہو سکتا ہے [11]۔
اگرچہ نینو پارٹیکلز نے پودوں کی نشوونما پر اچھے فروغ دینے والے اثرات دکھائے ہیں، لیکن *H میں Fe₃O₄ نینو پارٹیکلز اور آپٹمائزڈ پلانٹ گروتھ ریگولیٹرز کے مشترکہ استعمال پر مطالعہ۔ پرفوریٹم * نایاب رہتے ہیں۔ اس علمی خلا کو پُر کرنے کے لیے، اس مطالعے نے ان وٹرو مورفوجینیسیس اور ثانوی میٹابولائٹ پروڈکشن پر ان کے مشترکہ اثرات کے اثرات کا جائزہ لیا تاکہ دواؤں کے پودوں کی خصوصیات کو بہتر بنانے کے لیے نئی بصیرت فراہم کی جا سکے۔ لہذا، اس مطالعے کے دو مقاصد ہیں: (1) پودے کی نشوونما کے ریگولیٹرز کے ارتکاز کو بہتر بنانا تاکہ کالس کی تشکیل، شوٹ ری جنریشن، اور وٹرو میں جڑ کو مؤثر طریقے سے فروغ دیا جا سکے۔ اور (2) وٹرو میں نمو کے پیرامیٹرز پر Fe₃O₄ نینو پارٹیکلز کے اثرات کا جائزہ لیں۔ مستقبل کے منصوبوں میں آب و ہوا (ان وٹرو) کے دوران دوبارہ پیدا ہونے والے پودوں کی بقا کی شرح کا جائزہ لینا شامل ہے۔ توقع کی جاتی ہے کہ اس مطالعے کے نتائج سے *H کی مائکرو پروپیگیشن کی کارکردگی میں نمایاں بہتری آئے گی۔ perforatum*، اس طرح اس اہم دواؤں کے پودے کے پائیدار استعمال اور بائیوٹیکنالوجیکل ایپلی کیشنز میں حصہ ڈالتا ہے۔
اس مطالعے میں، ہم نے کھیت میں اگائے جانے والے سالانہ سینٹ جان کے پودے (مدر پلانٹس) سے لیف ایکسپلانٹس حاصل کیے۔ یہ وضاحتیں وٹرو ثقافت کے حالات کو بہتر بنانے کے لیے استعمال کی گئی تھیں۔ کاشت کرنے سے پہلے، پتوں کو بہتے ہوئے پانی میں کئی منٹ تک اچھی طرح سے دھویا جاتا تھا۔ اس کے بعد ایکسپلانٹ سطحوں کو 70% ایتھنول میں 30 سیکنڈ کے لیے ڈبو کر جراثیم کش کیا گیا، اس کے بعد 1.5% سوڈیم ہائپوکلورائٹ (NaOCl) محلول میں 10 منٹ کے لیے Tween 20 کے چند قطرے ڈال کر ڈبو دیا گیا۔ آخر میں، اگلے کلچر میڈیم میں منتقل ہونے سے پہلے ایکسپلانٹس کو جراثیم سے پاک آست پانی سے تین بار دھویا گیا۔
اگلے چار ہفتوں میں، شوٹ کی تخلیق نو کے پیرامیٹرز کی پیمائش کی گئی، بشمول تخلیق نو کی شرح، شوٹ نمبر فی ایکسپلانٹ، اور شوٹ کی لمبائی۔ جب دوبارہ پیدا ہونے والی ٹہنیاں کم از کم 2 سینٹی میٹر کی لمبائی تک پہنچ جاتی ہیں، تو انہیں ایک جڑ والے میڈیم میں منتقل کیا جاتا ہے جس میں نصف طاقت MS میڈیم، 0.5 mg/L indolebutyric acid (IBA) اور 0.3% گوار گم شامل ہوتا ہے۔ روٹنگ کلچر تین ہفتوں تک جاری رہا، اس دوران جڑوں کی شرح، جڑ کی تعداد، اور جڑ کی لمبائی کی پیمائش کی گئی۔ ہر علاج کو تین بار دہرایا گیا، ہر ایک نقل میں کلچر 10 ایکسپلانٹس کے ساتھ، فی علاج تقریباً 30 ایکسپلانٹس حاصل کرتے ہیں۔
پودے کی اونچائی سنٹی میٹر (سینٹی میٹر) میں ایک حکمران کا استعمال کرتے ہوئے، پودے کی بنیاد سے سب سے اونچے پتے کے سرے تک ناپی گئی۔ بیجوں کو احتیاط سے ہٹانے اور بڑھتے ہوئے درمیانے کو ہٹانے کے فوراً بعد جڑ کی لمبائی ملی میٹر (ملی میٹر) میں ناپی گئی۔ ہر ایک پلانٹ پر کلیوں کی تعداد براہ راست ہر پودے پر شمار کی جاتی تھی۔ پتوں پر کالے دھبوں کی تعداد، جسے نوڈولس کہا جاتا ہے، کو بصری طور پر ناپا گیا۔ خیال کیا جاتا ہے کہ یہ سیاہ نوڈول ہائپریسین، یا آکسیڈیٹیو دھبوں پر مشتمل غدود ہیں، اور علاج کے لیے پودوں کے ردعمل کے جسمانی اشارے کے طور پر استعمال ہوتے ہیں۔ تمام بڑھتے ہوئے میڈیم کو ہٹانے کے بعد، بیجوں کے تازہ وزن کو ملی گرام (ملی گرام) کی درستگی کے ساتھ الیکٹرانک پیمانے کا استعمال کرتے ہوئے ناپا گیا۔
کالس کی تشکیل کی شرح کا حساب لگانے کا طریقہ درج ذیل ہے: مختلف گروتھ ریگولیٹرز (کناز، 2,4-D، اور Fe3O4) پر مشتمل میڈیم میں چار ہفتوں تک ایکسپلانٹس کو کلچر کرنے کے بعد، کالس بنانے کے قابل ایکسپلانٹس کی تعداد شمار کی جاتی ہے۔ کالس کی تشکیل کی شرح کا حساب لگانے کا فارمولا درج ذیل ہے:
ہر علاج کو تین بار دہرایا گیا ، ہر تکرار میں کم از کم 10 وضاحتیں جانچیں۔
تخلیق نو کی شرح کالس ٹشو کے تناسب کی عکاسی کرتی ہے جو کالس کی تشکیل کے مرحلے کے بعد بڈ تفریق کے عمل کو کامیابی سے مکمل کرتا ہے۔ یہ اشارے کالس ٹشو کی مختلف بافتوں میں تبدیل ہونے اور پودوں کے نئے اعضاء میں بڑھنے کی صلاحیت کو ظاہر کرتا ہے۔
روٹنگ گتانک شاخوں کی تعداد کا تناسب ہے جو شاخوں کی کل تعداد سے جڑنے کے قابل ہیں۔ یہ اشارے جڑ پکڑنے کے مرحلے کی کامیابی کی عکاسی کرتا ہے، جو مائیکرو پروپیگیشن اور پودوں کی افزائش میں بہت اہم ہے، کیونکہ اچھی جڑیں پودوں کو بڑھتے ہوئے حالات میں بہتر طور پر زندہ رہنے میں مدد دیتی ہیں۔
Hypericin مرکبات 90% میتھانول کے ساتھ نکالے گئے تھے۔ پچاس ملی گرام خشک پودوں کے مواد کو 1 ملی لیٹر میتھانول میں شامل کیا گیا اور اندھیرے میں کمرے کے درجہ حرارت پر الٹراسونک کلینر (ماڈل A5120-3YJ) میں 30 kHz پر 20 منٹ کے لیے سونیکیٹ کیا گیا۔ سونیکیشن کے بعد، نمونے کو 15 منٹ کے لیے 6000 rpm پر سینٹرفیوج کیا گیا۔ سپرنٹنٹ کو جمع کیا گیا تھا، اور ہائپریسین کے جذب کو 592 nm پر پلس-3000 S سپیکٹرو فوٹومیٹر کا استعمال کرتے ہوئے اس طریقہ کے مطابق ماپا گیا تھا جسے Conceiçao et al. [14]۔
پودوں کی نشوونما کے ریگولیٹرز (PGRs) اور آئرن آکسائیڈ نینو پارٹیکلز (Fe₃O₄-NPs) کے ساتھ زیادہ تر علاج دوبارہ تخلیق شدہ شوٹ پتوں پر سیاہ نوڈول کی تشکیل کو متاثر نہیں کرتے ہیں۔ 0.5 یا 1 mg/L 2,4-D، 0.5 یا 1 mg/L کائنٹین، یا 1، 2، یا 4 mg/L آئرن آکسائیڈ نینو پارٹیکلز کے ساتھ کسی بھی علاج میں کوئی نوڈولس نہیں دیکھے گئے۔ کچھ مجموعوں نے کائینٹین اور/یا آئرن آکسائیڈ نینو پارٹیکلز کے زیادہ ارتکاز پر نوڈول کی نشوونما میں معمولی اضافہ (لیکن اعدادوشمار کے لحاظ سے اہم نہیں) دکھایا، جیسے 2,4-D (0.5–2 mg/L) کا کائنٹین (1–1.5 mg/L) اور آئرن پارٹ mg/L)۔ یہ نتائج شکل 2 میں دکھائے گئے ہیں۔ سیاہ نوڈول ہائپریسین سے بھرپور غدود کی نمائندگی کرتے ہیں، دونوں قدرتی طور پر پائے جاتے ہیں اور فائدہ مند۔ اس تحقیق میں، سیاہ نوڈولس بنیادی طور پر ٹشوز کے بھورا ہونے سے وابستہ تھے، جو ہائپریسین جمع کرنے کے لیے سازگار ماحول کی نشاندہی کرتے ہیں۔ 2,4-D، kinetin، اور Fe₃O₄ نینو پارٹیکلز کے ساتھ علاج نے کالس کی نشوونما کو فروغ دیا، بھورے پن کو کم کیا، اور کلوروفل کے مواد میں اضافہ ہوا، جس سے میٹابولک فنکشن میں بہتری اور آکسیڈیٹیو نقصان کی ممکنہ کمی کی تجویز ہوتی ہے [37]۔ اس مطالعہ نے سینٹ جان کے ورٹ کالس (تصویر 3a–g) کی نشوونما اور نشوونما پر 2,4-D اور Fe₃O₄ نینو پارٹیکلز کے ساتھ مل کر کینیٹین کے اثرات کا جائزہ لیا۔ پچھلے مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ Fe₃O₄ نینو پارٹیکلز میں اینٹی فنگل اور اینٹی مائکروبیل سرگرمیاں ہوتی ہیں [38, 39] اور، جب پودوں کی نشوونما کے ریگولیٹرز کے ساتھ مل کر استعمال کیا جاتا ہے، تو پودوں کے دفاعی طریقہ کار کو متحرک کر سکتا ہے اور سیلولر تناؤ کے اشاریوں کو کم کر سکتا ہے [18]۔ اگرچہ ثانوی میٹابولائٹس کی حیاتیاتی ترکیب جینیاتی طور پر منظم ہوتی ہے، لیکن ان کی اصل پیداوار ماحولیاتی حالات پر بہت زیادہ منحصر ہوتی ہے۔ میٹابولک اور مورفولوجیکل تبدیلیاں پودوں کے مخصوص جینوں کے اظہار کو منظم کرکے اور ماحولیاتی عوامل کا جواب دے کر ثانوی میٹابولائٹ کی سطح کو متاثر کر سکتی ہیں۔ مزید برآں، inducers نئے جینوں کی ایکٹیویشن کو متحرک کر سکتے ہیں، جس کے نتیجے میں انزیمیٹک سرگرمی کی حوصلہ افزائی ہوتی ہے، بالآخر متعدد بایو سنتھیٹک راستوں کو چالو کرتی ہے اور ثانوی میٹابولائٹس کی تشکیل کا باعث بنتی ہے۔ مزید برآں، ایک اور تحقیق سے پتہ چلتا ہے کہ شیڈنگ کو کم کرنے سے سورج کی روشنی میں اضافہ ہوتا ہے، اس طرح *Hypericum perforatum* کے قدرتی رہائش گاہ میں دن کے وقت کا درجہ حرارت بڑھتا ہے، جو کہ ہائپریسین کی پیداوار میں بھی اضافہ کرتا ہے۔ ان اعداد و شمار کی بنیاد پر، اس مطالعہ نے ٹشو کلچر میں ممکنہ inducers کے طور پر آئرن نینو پارٹیکلز کے کردار کی چھان بین کی۔ نتائج سے معلوم ہوا کہ یہ نینو پارٹیکلز ہیسپریڈین بائیو سنتھیسز میں شامل جینز کو اینزائیمیٹک محرک کے ذریعے متحرک کر سکتے ہیں، جس کے نتیجے میں اس کمپاؤنڈ کے جمع ہونے میں اضافہ ہوتا ہے (تصویر 2)۔ لہٰذا، قدرتی حالات میں بڑھنے والے پودوں کے مقابلے میں، یہ دلیل دی جا سکتی ہے کہ ویوو میں ایسے مرکبات کی پیداوار کو بھی بڑھایا جا سکتا ہے جب اعتدال پسند تناؤ کو ثانوی میٹابولائٹس کے بائیو سنتھیسز میں شامل جینوں کے فعال ہونے کے ساتھ ملایا جائے۔ مشترکہ علاج عام طور پر تخلیق نو کی شرح پر مثبت اثر ڈالتے ہیں، لیکن بعض صورتوں میں، یہ اثر کمزور ہو جاتا ہے۔ خاص طور پر، 1 mg/L 2,4-D، 1.5 mg/L kinase، اور مختلف ارتکاز کے ساتھ علاج سے کنٹرول گروپ (تصویر 4c) کے مقابلے میں آزادانہ اور نمایاں طور پر تخلیق نو کی شرح میں 50.85 فیصد اضافہ ہو سکتا ہے۔ یہ نتائج بتاتے ہیں کہ نانو ہارمونز کے مخصوص امتزاج پودوں کی نشوونما اور میٹابولائٹ کی پیداوار کو فروغ دینے کے لیے ہم آہنگی سے کام کر سکتے ہیں، جو دواؤں کے پودوں کی ٹشو کلچر کے لیے بہت اہمیت کا حامل ہے۔ پامر اور کیلر [50] نے ظاہر کیا کہ 2,4-D علاج سینٹ پرفوریٹم میں کالس کی تشکیل کو آزادانہ طور پر آمادہ کر سکتا ہے، جبکہ کناز کے اضافے سے کالس کی تشکیل اور تخلیق نو میں نمایاں اضافہ ہوا ہے۔ یہ اثر ہارمونل توازن میں بہتری اور سیل ڈویژن کے محرک کی وجہ سے تھا۔ بال وغیرہ۔ [51] نے پایا کہ Fe₃O₄-NP کا علاج آزادانہ طور پر اینٹی آکسیڈینٹ انزائمز کے کام کو بڑھا سکتا ہے، اس طرح سینٹ پرفوریٹم میں جڑوں کی نشوونما کو فروغ دیتا ہے۔ 0.5 mg/L، 1 mg/L، اور 1.5 mg/L کے ارتکاز میں Fe₃O₄ نینو پارٹیکلز پر مشتمل کلچر میڈیا نے سن پودوں کی تخلیق نو کی شرح کو بہتر بنایا [52]۔ kinetin، 2,4-dichlorobenzothiazolinone، اور Fe₃O₄ نینو پارٹیکلز کے استعمال نے کالس اور جڑوں کی تشکیل کی شرح کو نمایاں طور پر بہتر کیا، تاہم، وٹرو کی تخلیق نو کے لیے ان ہارمونز کے استعمال کے ممکنہ ضمنی اثرات پر غور کرنے کی ضرورت ہے۔ مثال کے طور پر، 2,4-dichlorobenzothiazolinone یا kinetin کے طویل مدتی یا زیادہ ارتکاز کے استعمال کے نتیجے میں سومیٹک کلونل تغیر، آکسیڈیٹیو تناؤ، غیر معمولی کالس مورفولوجی، یا وٹریفیکیشن ہو سکتا ہے۔ لہذا، ایک اعلی تخلیق نو کی شرح ضروری طور پر جینیاتی استحکام کی پیش گوئی نہیں کرتی ہے۔ تمام دوبارہ پیدا ہونے والے پودوں کا اندازہ مالیکیولر مارکر (جیسے RAPD، ISSR، AFLP) یا سائٹوجنیٹک تجزیہ کے ذریعے کیا جانا چاہیے تاکہ ان کی یکسانیت اور ویوو پودوں سے مماثلت کا تعین کیا جا سکے [53,54,55]۔
اس مطالعے نے پہلی بار یہ ظاہر کیا کہ Fe₃O₄ نینو پارٹیکلز کے ساتھ پودوں کی نشوونما کے ریگولیٹرز (2,4-D اور kinetin) کا مشترکہ استعمال *Hypericum perforatum* میں کلیدی بائیو ایکٹیو میٹابولائٹس (بشمول ہائپریسین اور ہائپروسائیڈ) کے جمع ہونے اور مورفوجینیسیس کو بڑھا سکتا ہے۔ بہتر علاج کے طریقہ کار (1 mg/L 2,4-D + 1 mg/L kinetin + 4 mg/L Fe₃O₄-NPs) نہ صرف کالس کی تشکیل، آرگنوجنیسیس، اور ثانوی میٹابولائٹ پیداوار کو زیادہ سے زیادہ بڑھاتا ہے بلکہ ایک ہلکے حوصلہ افزا اثر کا بھی مظاہرہ کرتا ہے، جس سے پودے کی قدر میں بہتری آتی ہے۔ نینو ٹیکنالوجی اور پودوں کے ٹشو کلچر کا امتزاج دواؤں کے مرکبات کی بڑے پیمانے پر وٹرو پیداوار کے لیے ایک پائیدار اور موثر پلیٹ فارم فراہم کرتا ہے۔ یہ نتائج صنعتی ایپلی کیشنز اور مالیکیولر میکانزم، خوراک کی اصلاح اور جینیاتی درستگی میں مستقبل کی تحقیق کے لیے راہ ہموار کرتے ہیں، اس طرح دواؤں کے پودوں پر بنیادی تحقیق کو عملی بائیو ٹیکنالوجی سے جوڑتے ہیں۔