اینتھلمینٹک دوا N,N-diethyl-m-toluamide (ڈی ای ای ٹی) ACHE (acetylcholinesterase) کو روکنے کی اطلاع دی گئی ہے اور ضرورت سے زیادہ ویسکولرائزیشن کی وجہ سے ممکنہ سرطان پیدا کرنے والی خصوصیات ہیں۔ اس مقالے میں، ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ DEET خاص طور پر اینڈوتھیلیل سیلز کو متحرک کرتا ہے جو انجیوجینیسیس کو فروغ دیتے ہیں، اس طرح ٹیومر کی نشوونما میں اضافہ ہوتا ہے۔ DEET سیلولر عمل کو چالو کرتا ہے جو انجیوجینیسیس کا باعث بنتا ہے، بشمول پھیلاؤ، منتقلی، اور آسنجن۔ یہ اینڈوتھیلیل خلیوں میں NO پیداوار اور VEGF اظہار کے ساتھ وابستہ ہے۔ M3 کو خاموش کرنے یا فارماسولوجیکل M3 inhibitors کے استعمال نے ان تمام اثرات کو ختم کر دیا، یہ تجویز کرتا ہے کہ DEET سے متاثر انجیوجینیسیس M3-حساس ہے۔ اینڈوتھیلیل اور HEK سیلز میں کیلشیم سگنلنگ کے تجربات جن میں M3 ریسیپٹرز کو زیادہ متاثر کیا جاتا ہے، نیز بائنڈنگ اور ڈاکنگ اسٹڈیز سے پتہ چلتا ہے کہ DEET M3 ریسیپٹرز کے اللوسٹرک ماڈیولر کے طور پر کام کرتا ہے۔ مزید برآں، DEET ACHE کو روکتا ہے، اس طرح acetylcholine کی حیاتیاتی دستیابی میں اضافہ ہوتا ہے اور M3 ریسیپٹرز کے ساتھ اس کا پابند ہوتا ہے، اور allosteric ریگولیشن کے ذریعے proangiogenic اثرات کو بڑھاتا ہے۔
پرائمری ای سی کو سوئس چوہوں کی شہ رگ سے الگ تھلگ کیا گیا تھا۔ نکالنے کا طریقہ کوبایشی پروٹوکول 26 سے اپنایا گیا تھا۔ مورائن ECs کو EBM-2 میڈیم میں کلچر کیا گیا تھا جو چوتھے گزرنے تک 5% ہیٹ سے غیر فعال FBS کے ساتھ اضافی تھا۔
HUVEC، U87MG، یا BF16F10 کے پھیلاؤ پر DEET کے دو ارتکاز کے اثر کا تجزیہ CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026) کے ذریعے کیا گیا۔ مختصراً، 5.103 سیل فی کنواں ایک 96 کنویں کی پلیٹ میں سیڈ کیے گئے، انہیں راتوں رات جوڑنے کی اجازت دی گئی، اور پھر 24 گھنٹے تک DEET کے ساتھ علاج کیا گیا۔ گروتھ میڈیم کو ہٹانے کے بعد، مائکرو پلیٹ کے ہر کنویں میں ڈائی بائنڈنگ سلوشن شامل کریں اور سیلز کو 37 ° C پر 30 منٹ تک انکیوبیٹ کریں۔ فلوروسینس لیولز کا تعین Mithras LB940 ملٹی موڈ مائیکرو پلیٹ ریڈر (برتھولڈ ٹیکنالوجیز، بیڈ وائلڈ بیڈ، جرمنی) کے ذریعے کیا گیا تھا جو 485 nm ایکسائٹیشن فلٹرز اور 530 nm اخراج فلٹرز سے لیس تھا۔
HUVEC کو 96 کنویں پلیٹوں میں 104 سیل فی کنواں کی کثافت پر سیڈ کیا گیا تھا۔ خلیوں کا 24 گھنٹے تک DEET کے ساتھ علاج کیا گیا۔ سیل کی قابل عملیت کا اندازہ رنگین میٹرک ایم ٹی ٹی پرکھ (سگما-الڈرچ، M5655) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ آپٹیکل کثافت کی قدریں ملٹی موڈ مائکروپلیٹ ریڈر (Mithras LB940) پر 570 nm کی طول موج پر حاصل کی گئیں۔
DEET کے اثرات کا مطالعہ وٹرو انجیوجینیسیس اسسیس کے ذریعے کیا گیا۔ 10-8 M یا 10-5 M DEET کے ساتھ علاج سے HUVECs (تصویر 1a، b، سفید سلاخوں) میں کیپلیری لمبائی کی تشکیل میں اضافہ ہوا۔ کنٹرول گروپ کے مقابلے میں، 10-14 سے 10-5 M کے درمیان DEET ارتکاز کے ساتھ علاج سے پتہ چلتا ہے کہ کیپلیری کی لمبائی 10-8 M DEET پر سطح مرتفع تک پہنچ گئی ہے (ضمنی شکل S2)۔ 10-8 M اور 10-5 M کی حراستی کی حد میں DEET کے ساتھ علاج کیے جانے والے HUVECs کے وٹرو پروانجیوجینک اثر میں کوئی خاص فرق نہیں پایا گیا۔
neovascularization پر DEET کے اثر کا تعین کرنے کے لیے، ہم نے vivo neovascularization کے مطالعے میں کارکردگی کا مظاہرہ کیا۔ 14 دن کے بعد، چوہوں کو 10-8 M یا 10-5 M DEET کے ساتھ پری کلچر شدہ اینڈوتھیلیل سیلز کے ساتھ انجکشن لگائے جانے سے ہیموگلوبن کی مقدار میں نمایاں اضافہ ہوا (تصویر 1c، سفید سلاخوں)۔
مزید برآں، U87MG xenograft-bearing چوہوں میں DEET-حوصلہ افزائی نیووسکولرائزیشن کا مطالعہ کیا گیا تھا جنہیں روزانہ (ip) DEET کے ساتھ ایک خوراک پر لگایا جاتا تھا جو 10-5 M کے پلازما کی تعداد کو دلانے کے لیے جانا جاتا ہے، جو کہ بے نقاب انسانوں میں معمول کی بات ہے۔ چوہوں میں U87MG خلیوں کے انجیکشن کے 14 دن بعد قابل شناخت ٹیومر (یعنی ٹیومر> 100 mm3) دیکھے گئے۔ 28 ویں دن، ٹیومر کی نشوونما کو کنٹرول چوہوں (تصویر 1d، چوکوں) کے مقابلے ڈی ای ای ٹی سے علاج شدہ چوہوں میں نمایاں طور پر بڑھایا گیا۔ مزید برآں، ٹیومر کے CD31 داغ سے ظاہر ہوتا ہے کہ ڈی ای ای ٹی نے کیپلیری ایریا میں نمایاں اضافہ کیا ہے لیکن مائیکرو ویسل کثافت نہیں۔ (تصویر 1e-g)۔
DETA کی حوصلہ افزائی کے پھیلاؤ میں muscarinic ریسیپٹرز کے کردار کا تعین کرنے کے لیے، pFHHSiD (10-7 M، ایک سلیکٹیو M3 ریسیپٹر مخالف) کی موجودگی میں 10-8 M یا 10-5 M DETA استعمال کیا گیا تھا۔ HUVEC کا علاج۔ pFHHSiD نے تمام ارتکاز (ٹیبل 1) پر DETA کی پھیلاؤ والی خصوصیات کو مکمل طور پر مسدود کردیا۔
ان شرائط کے تحت، ہم نے یہ بھی جانچا کہ آیا DEET HUVEC خلیوں میں کیپلیری کی لمبائی میں اضافہ کرے گا۔ اسی طرح، pFHHSiD نے DEET-حوصلہ افزائی کیپلیری لمبائی (تصویر 1a، b، گرے بارز) کو نمایاں طور پر روکا۔ مزید برآں، اسی طرح کے تجربات M3 siRNA کے ساتھ کیے گئے۔ اگرچہ کنٹرول siRNA کیپلیری کی تشکیل کو فروغ دینے میں مؤثر نہیں تھا، M3 مسکرینک ریسیپٹر کو خاموش کرنے سے کیپلیری کی لمبائی میں اضافہ کرنے کی ڈی ای ای ٹی کی صلاحیت ختم ہوگئی (تصویر 1 اے، بی، بلیک بارز)۔
مزید برآں، وٹرو میں 10-8 M یا 10-5 M DEET-حوصلہ افزائی vascularization اور vivo میں neovascularization دونوں کو pFHHSiD (تصویر 1c، d، حلقوں) کے ذریعے مکمل طور پر روک دیا گیا تھا۔ یہ نتائج بتاتے ہیں کہ DEET منتخب M3 ریسیپٹر مخالف یا M3 siRNA کے لیے حساس راستے کے ذریعے انجیوجینیسیس کو فروغ دیتا ہے۔
ACHE DEET کا سالماتی ہدف ہے۔ ڈونپیزل جیسی دوائیں، جو ACHE روکنے والوں کے طور پر کام کرتی ہیں، وٹرو میں اور ماؤس ہندلمب اسکیمیا ماڈلز میں EC انجیوجینیسیس کو متحرک کرسکتی ہیں۔ ہم نے HUVEC میں ACHE اینزائم سرگرمی پر DEET کے دو ارتکاز کے اثر کا تجربہ کیا۔ DEET کی کم (10-8 M) اور زیادہ (10-5 M) ارتکاز نے کنٹرول کے حالات (تصویر 2) کے مقابلے اینڈوتھیلیل ACHE سرگرمی میں کمی کی۔
DEET کے دونوں ارتکاز (10-8 M اور 10-5 M) نے HUVEC پر acetylcholinesterase سرگرمی کو کم کیا۔ BW284c51 (10-5 M) کو acetylcholinesterase inhibitors کے کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ نتائج کا اظہار HUVEC پر ACHE سرگرمی کے فیصد کے طور پر کیا جاتا ہے جس کا علاج گاڑی سے علاج کیے جانے والے خلیوں کے مقابلے DEET کے دو ارتکاز کے ساتھ کیا جاتا ہے۔ اقدار کو چھ آزاد تجربوں کے اوسط ± SEM کے طور پر ظاہر کیا جاتا ہے۔ * پی <0.05 کنٹرول کے مقابلے میں (کرسکل والس اور ڈن ایک سے زیادہ موازنہ ٹیسٹ)۔
نائٹرک آکسائیڈ (NO) انجیوجینک عمل 33 میں شامل ہے، لہذا، DEET-حوصلہ افزائی HUVECs میں کوئی پیداوار کا مطالعہ نہیں کیا گیا۔ DEET سے علاج شدہ اینڈوتھیلیل NO کی پیداوار کو کنٹرول سیلز کے مقابلے میں بڑھایا گیا تھا، لیکن صرف 10-8 M (تصویر 3c) کی خوراک پر اہمیت تک پہنچ گئی۔ DEET-حوصلہ افزائی NO پیداوار کو کنٹرول کرنے والی مالیکیولر تبدیلیوں کا تعین کرنے کے لیے، eNOS اظہار اور ایکٹیویشن کا مغربی بلاٹنگ کے ذریعے تجزیہ کیا گیا۔ اگرچہ DEET کے علاج سے eNOS اظہار میں کوئی تبدیلی نہیں آئی، لیکن اس نے اپنی فعال کرنے والی سائٹ (Ser-1177) پر eNOS فاسفوریلیشن میں نمایاں اضافہ کیا جبکہ eNOS فاسفوریلیشن (تصویر 3d) میں علاج نہ کیے جانے والے خلیوں کے مقابلے اس کی روک تھام کی جگہ (Thr-495) کو کم کیا۔ مزید برآں، ایکٹیویشن سائٹ اور انحیبیٹری سائٹ پر فاسفوریلیٹڈ ای این او ایس کے تناسب کا حساب انزائم کی کل مقدار میں فاسفوریلیٹ ای این او ایس کی مقدار کو معمول پر لانے کے بعد کیا گیا۔ علاج نہ کیے جانے والے خلیوں (تصویر 3d) کے مقابلے DEET کے ہر ارتکاز کے ساتھ علاج کیے جانے والے HUVECs میں یہ تناسب نمایاں طور پر بڑھ گیا تھا۔
آخر میں، وی ای جی ایف کے اظہار کا، ایک اہم پروانجیوجینک عوامل، مغربی بلوٹنگ کے ذریعے تجزیہ کیا گیا۔ DEET نے VEGF اظہار میں نمایاں اضافہ کیا، جبکہ pFHHSiD نے اس اظہار کو مکمل طور پر مسدود کردیا۔
چونکہ DEET کے اثرات فارماسولوجیکل ناکہ بندی اور M3 ریسیپٹرز کی تنزلی دونوں کے لیے حساس ہیں، اس لیے ہم نے اس مفروضے کا تجربہ کیا کہ DEET کیلشیم سگنلنگ کو بڑھا سکتا ہے۔ حیرت انگیز طور پر، DEET HUVEC (ڈیٹا نہیں دکھایا گیا) اور HEK/M3 (تصویر 4a، b) میں استعمال شدہ دونوں ارتکاز کے لیے سائٹوپلاسمک کیلشیم بڑھانے میں ناکام رہا۔
پوسٹ ٹائم: دسمبر-30-2024